目的:奥沙利铂是消化道恶性肿瘤一线化疗药物,其诱发神经病理性疼痛(CINP)发病率达76%-90%,发病机制与痛觉敏化和神经细胞凋亡密切相关,目前尚缺乏防治药物,本病属中医“血痹”范畴,专属方剂为黄芪桂枝五物汤。本研究以奥沙利铂化疗药物诱导的神经病理性疼痛(Chemotherapy-induced neuropathic pain,CINP)大鼠模型为研究对象,运用细胞生物分子检测方法,检测MAPK通路上游TNF-α,IL-1β,IL-6炎症因子的表达、MAPK家族成员ERK1/2、p38、JNK蛋白的表达、以及通路下游关键蛋白c-Fos,CREB,Nf-κB蛋白的表达,探讨黄芪桂枝五物汤的降低痛觉敏化及抗背根神经节损伤的作用,进而阐述以“温经通痹”治法的黄芪桂枝五物汤预防和修复由奥沙利铂化疗药物诱导的CINP大鼠神经细胞损伤的作用机制,从而为黄芪桂枝五物汤防治CINP的临床应用提供科学依据。材料与方法:1.实验一SPF级雌性SD大鼠45只,体质量200~220g,采用完全随机的方法将大鼠分为空白组(不做处理)、模型组(奥沙利铂化疗造CINP慢性模型)、西药防治组(奥沙利铂化疗造模+度洛西汀灌胃)、中药灌胃防治组(奥沙利铂化疗造模+黄芪桂枝五物汤灌胃)、中药泡洗防治组(奥沙利铂化疗造模+黄芪桂枝五物汤泡洗),每组9只,连续治疗15天,治疗同时在指定日期(第0、3、6、9、12、15天)对大鼠体重、机械痛阈值、冷阈值、热痛阈值进行检测。在第15天,将大鼠禁食但可自由饮水24小时后,采用10%水合氯醛(以3 m L/kg体重)进行腹腔注射麻醉,然后将大鼠仰卧位固定于鼠台上,备皮后用碘伏消毒大鼠腹部皮肤,剪开皮肤及腹膜,显现腹主动脉,注射器缓慢抽血,动脉血静置于4℃保温箱中2h,以2000转/min,离心15min,取上层淡黄色液体(血清)分别放入标记好的无菌EP管中,-80℃冰箱中冻存备用。为了防止金属污染组织,使用灭菌过的陶瓷刀切去大鼠腰椎L4-L5旁所需神经节上下游多余神经,获取L4-L5椎间孔处神经,取得大鼠L4-L5脊髓背根神经节共4对,用1.5m L冻存管封装,置于-80℃冰箱冷冻保存。ELISA法测血清中TNF-α,IL-1β,IL-6炎症因子含量,HE染色对大鼠L4-L5脊髓背根神经组织病理形态学观察。2.实验二SPF级雌性SD大鼠30只,体质量200~220g,采用完全随机的方法将大鼠分为空白组(不做处理)、模型组(奥沙利铂化疗造模)、西药防治组(奥沙利铂化疗造模+度洛西汀灌胃)、中药灌胃防治组(奥沙利铂化疗造模+黄芪桂枝五物汤灌胃)、中药泡洗防治组(奥沙利铂化疗造模+黄芪桂枝五物汤泡洗),每组6只,连续治疗15天。在第15天,将大鼠禁食但可自由饮水24小时后,采用10%水合氯醛(以3 m L/kg体重)进行腹腔注射麻醉,然后将大鼠仰卧位固定于鼠台上,备皮后用碘伏消毒大鼠腹部皮肤,剪开皮肤及腹膜,显现腹主动脉,注射器缓慢抽血,注射器缓慢抽血处死。为了防止金属污染组织,使用灭菌过的陶瓷刀切去大鼠脊髓L4-L5旁所需神经节上下游多余神经,获取L4-L5椎间孔处神经,取得大鼠L4-L5脊髓背根神经节共4对,用1.5m L冻存管封装,置于-80℃冰箱冷冻保存。Western-blot检测大鼠L4-L5脊髓背根神经节组织中ERK1/2,P38,JNK,c-Fos,CREB,Nf-κB蛋白表达量,IHC免疫组化检测L4-L5脊髓背根神经节组织中,ERK1/2,p38,JNK蛋白表达量。3.各组大鼠实验数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析,各组数据以均数±标准差(x±s)来表示,多组计量资料的均数比较方差齐性,采用单因素随机化设计的方差分析,当P<0.05时为差异有统计学意义。结果:1.各组大鼠体重结果显示:在基线时(第0天),各组大鼠的体重没有统计学差异(P>0.05);随着化疗药物奥沙利铂的应用,第6天开始奥沙利铂诱导的模型组大鼠、西药度洛西汀防治组及黄芪桂枝五物汤灌胃防治组大鼠的体重增长速度减慢,与空白组大鼠比较有统计学差异(P<0.05),黄芪桂枝五物汤灌胃防治组大鼠体重增长减慢持续到第12天,西药度洛西汀防治组、模型组大鼠持续到第15天;西药度洛西汀防治组对于防治奥沙利铂化疗引起的体重增长缓慢无效果,黄芪桂枝五物汤灌胃对于防治奥沙利铂化疗引起的体重增长缓慢有一定的效果,但黄芪桂枝五物汤外用泡洗的效果有突出显著优势,此组大鼠的体重增长与空白组大鼠,在各个时间点比较(第0、3、6、9、12、15天),没有统计学差异(P>0.05)。2.各组大鼠机械痛阈值结果显示:在基线时(第0天),各组大鼠的机械痛阈值,没有统计学差异,随着化疗药物奥沙利铂的应用,第9天开始出现模型组大鼠机械痛阈逐渐降低持续到第15天,机械痛阈值在(第9、12、15天)时间节点与空白组大鼠比较有统计学差异(P<0.05),西药度洛西汀防治组、黄芪桂枝五物汤灌胃及泡洗组对于防治机械痛阈值下降有一定效果。西药度洛西汀及黄芪桂枝五物汤灌胃对于治疗奥沙利铂诱导的机械痛阈值下降,有一定的治疗效果(第12、15天)时,但两者之间的防治效果在各个时间点无显著性差异;黄芪桂枝五物汤外用泡洗对于防治奥沙利铂诱导的疼痛阈值的下降有较好的效果,大鼠的机械痛阈值在多个时间点(第3、6、12、15天)没有下降,与空白组大鼠比较,没有统计学差(P>0.05),防治效果优于西药度洛西汀与黄芪桂枝五物汤灌胃,在第12、15天时比较,有统计学差异(P<0.05)。3.各组大鼠痛阈值显示:在基线时(第0天),各组大鼠的冷痛阈值没有统计学差异;随着化疗药物奥沙利铂的应用第6天开始,模型组大鼠冷痛阈值逐渐降低,一直持续到第15天,冷痛阈值在(第6、9、12、15天)时间节点与空白组大鼠比较,有统计学差异(P<0.05),西药度洛西汀、黄芪桂枝五物汤灌胃及泡洗对于防治冷痛阈值下降有一定效果。西药度洛西汀对于防治奥沙利铂诱导的冷痛阈值下降有一定的治疗效果,与模型组比较,在(第6、9、12、15天)时冷痛阈值下降幅度低,有统计学差异(P<0.05);黄芪桂枝五物汤灌胃对于防治奥沙利铂诱导的冷阈值下降也有一定的治疗效果,与模型组比较,在(第6、12、15天)时冷痛阈值下降幅度小,有统计学差异(P<0.05);黄芪桂枝五物汤外用泡洗可以较好的抑制奥沙利铂化疗引起的大鼠的冷痛阈值得下降,在各个时间点(第3、6、15天)与空白组大鼠比较,没有统计学差异(P>0.05),黄芪桂枝五物汤外用泡洗对于防治奥沙利铂诱导的冷痛阈值下降有较好的效果,与模型组比较,在(第、9、12、15天)时冷阈值下降幅度小,有统计学差异(P<0.05),在(第12、15天)时与西药度洛西汀比较,在第15天时与黄芪桂枝五物汤灌胃防治相比较,有统计学差异(P<0.05),疗效突出显著。4.各组大鼠热痛阈值结果显示:大鼠热痛阈方面,在基线时(第0天),各组大鼠的热痛阈值没有统计学差异,随着化疗药物奥沙利铂的应用,模型组大鼠从第3天开始出现热痛阈逐渐降低,一直持续到第15天,模型组大鼠热痛阈值在(第3、6、9、12、15天)时间节点与空白组大鼠比较有统计学差异(P<0.05),西药度洛西汀、黄芪桂枝五物汤灌胃及泡洗对于防治热痛阈值下降有一定效果。西药度洛西汀对于防治奥沙利铂诱导的热痛阈值下降有一定的治疗效果,与慢性CINP模型比较,在(第3、9天)时,热痛阈值下降幅度低,有统计学差异(P<0.05);黄芪桂枝五物汤灌胃对于防治热痛阈值下降有一定效果,与CINP慢性模型比较,在(第12天)时,热痛阈值下降幅度低,有统计学差异(P<0.05);黄芪桂枝五物汤外用泡洗对于防治奥沙利铂化疗引起的大鼠的热痛阈值下降有较好防治效果,在多个时间点(第9、12、15天)时,与空白组大鼠比较,没有统计学差异(P>0.05),防治效果优于西药度洛西汀与黄芪桂枝五物汤灌胃,在第15天时比较,有统计学差异(P<0.05)。5.各组大鼠神经细胞病理形态学观察结果显示:空白组大鼠脊髓背根神经节细胞排列规则,细胞间距正常,细胞核大小正常;模型组大鼠脊髓背根神经节细胞排列紊乱,细胞间距正常增大,细胞核变小,可见疑似凋亡细胞,与正常神经细胞差异较大;西药组大鼠脊髓背根神经节细胞排列大致规则,局部可见细胞间距增大,细胞核略缩小;黄芪桂枝五物汤灌胃防治组大鼠脊髓背根神经节排列大致规则,局部可见细胞间距增大,细胞核略缩小,可见少量细胞凋亡,与西药组差异不明显;黄芪桂枝五物汤外用防治组大鼠脊髓背根神经节细胞细胞排列规则,细胞间距正常,细胞核大小正常,和正常神经细胞无显著差别。6.各组大鼠血清中TNF-α,IL-1β,IL-6炎症因子含量结果显示:与空白组比较,模型组、西药度洛西汀防治组、黄芪桂枝五物汤灌胃防治组和黄芪桂枝五物汤泡洗组,血清中TNF-α含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,西药度洛西汀防治组、黄芪桂枝五物汤灌胃防治组和黄芪桂枝五物汤泡洗防治组,血清中TNF-α含量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与西药度洛西汀防治组比较,黄芪桂枝五物汤灌胃防治组和黄芪桂枝五物汤泡洗组TNF-α含量,差异无统计学意义(P>0.05);与黄芪桂枝五物汤灌胃防治组比较,黄芪桂枝五物汤泡洗组TNF-α水含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较,模型组、西药度洛西汀防治组、黄芪桂枝五物汤灌胃防治组和黄芪桂枝五物汤泡洗防治组,血清中IL-1β含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,西药度洛西汀防治组、黄芪桂枝五物汤灌胃防治组和黄芪桂枝五物汤泡洗防治组,血清中IL-1β值显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与西药度洛西汀防治组比较,黄芪桂枝五物汤灌胃防治组和黄芪桂枝五物汤泡洗组IL-1β含量,差异无统计学意义(P>0.05);与黄芪桂枝五物汤灌胃防治组比较,黄芪桂枝五物汤泡洗组IL-1β含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较,模型组、西药度洛西汀防治组、黄芪桂枝五物汤灌胃防治组和黄芪桂枝五物汤泡洗组,血清中IL-6含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,西药度洛西汀防治组、黄芪桂枝五物汤灌胃防治组和黄芪桂枝五物汤泡洗防治组血清中IL-1β含量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与西药度洛西汀防治组比较,黄芪桂枝五物汤灌胃防治组IL-6含量升高,差异有统计学意义(P<0.05),黄芪桂枝五物汤泡洗组IL-6含量,差异无统计学意义(P>0.05);与黄芪桂枝五物汤灌胃防治组比较,黄芪桂枝五物汤泡洗组IL-6含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。7.WB检测各组大鼠L4-L5脊髓背根神经节组织中ERK1/2,p38,JNK,c-Fos,CREB,Nf-κB蛋白表达结果显示:与空白组比较,CINP模型组大鼠L4-L5脊髓背根神经节组织中,ERK1/2,p38,JNK,c-Fos,CREB,Nf-κB蛋白表达显著升高(P<0.05);西药组、黄芪桂枝五物汤灌胃和泡洗组都可以显著降低ERK1/2,p38,JNK,c-Fos,CREB,Nf-κB的蛋白表达水平(P<0.05)。西药组、黄芪桂枝五物汤灌胃和外用泡洗组JNK、CREB、Nf-κB的蛋白表达水平无显著差异(P>0.05),西药组和黄芪桂枝五物汤外用泡洗组,在降低ERK1/2,p38,c-Fos蛋白表达水平效果无显著差异(P>0.05),但都优于黄芪桂枝五物汤灌胃组(P<0.05)。8.IHC检测各组大鼠L4-L5脊髓背根神经节组织中ERK1/2,p38,JNK蛋白表达结果显示:与空白组比较,CINP模型组大鼠L4-L5脊髓背根神经节组织中,ERK1/2,p38,JNK蛋白表达显著升高(P<0.05);西药组、黄芪桂枝五物汤灌胃和泡洗组都可以显著降低ERK1/2,p38,JNK的蛋白表达水平(P<0.05);西药组、黄芪桂枝五物汤灌胃和外用泡洗组ERK1/2,p38,JNK蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)。结论:1.黄芪桂枝五物汤可以增加奥沙利铂诱导的慢性CINP大鼠体重,有效改善奥沙利铂诱导的慢性CINP大鼠模型痛觉敏化状态,拮抗机械痛阈值、冷痛阈值、热痛阈值下降出现的时间及下降幅度,外用泡洗效果优于灌胃。2.黄芪桂枝五物汤可以有效拮抗奥沙利铂对于大鼠脊髓背根神经节细胞的损伤,来达到有效的防治疗效,外用泡洗效果优于灌胃。3.黄芪桂枝五物汤可能通过下调奥沙利铂诱导的慢性CINP大鼠模型血清中TNF-α,IL-1β,IL-6炎症因子水平,达到抑制MAPK信号通路家族其所属ERK1/2,p38,JNK信号通路相关蛋白表达水平,进而降低下游关键蛋白c-Fos,CREB,Nf-κB蛋白的表达,进而达到抗神经细胞损伤及降低痛觉敏化状态,从而预防和修复由奥沙利铂化疗诱导的CINP大鼠神经细胞损伤的作用。