研究背景和目的：肺癌是发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一。80-90%的肺癌患者死亡是由转移所致。侵袭与转移是恶性肿瘤的本质特征之一,也是导致患者治疗失败和死亡的主要原因。因此,控制转移是决定癌症患者预后的关键因素。近些年来,国内外在肿瘤侵袭转移的研究上取得了较大进展,阐明了肿瘤侵袭转移的某些关键环节和机理,研制出了一些预防转移的药物,但至今尚无一种广泛用于临床预防肿瘤转移的药物。中医药疗法在肿瘤的治疗中有着悠久的历史和重要的地位。在长期医疗实践中,传统中医学形成了独特的恶性肿瘤防治的理论体系。祛瘀化痰法是恶性肿瘤尤其是肺癌的治疗大法之一。现代的有关实验研究显示：活血祛瘀、化痰散结药物是否有抗肿瘤及转移的作用仍存在较大的分歧。故本课题探讨祛瘀化痰法抗肺癌转移的分子机制有着现实意义。本课题在传统中医理论的指导下,本着辨证与辨病相结合、宏观辨证与微观辨证相结合的原则,通过“以方示法、以方测证”的原理。采用传统中医经典的祛瘀方(桃红四物汤)合化痰方(二陈汤)的祛瘀化痰法分别对西医的经典小鼠Lewis肺癌转移模型及人高转移性肺癌95-D细胞进行体内实验和体外实验,探讨祛瘀化痰法抗肺癌转移的分子机制。同时运用传统中医“证治”反证的思路,尝试探寻肺癌痰证及血瘀证的生物学本质,为传统中医理论创新及中医现代化提供积极的思路和借鉴。材料和方法：第一部分体内动物实验1、建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型2、动物模型随机分为8组：生理盐水对照组、祛瘀化痰方高剂量组、祛瘀化痰方低级剂量组、祛瘀方高剂量组、祛瘀方低剂量组、化痰方高剂量组、化痰方低剂量组及顺铂组,每组10只小鼠。分别用药21天实验中定期测量移植瘤体积变化及各组小鼠体重变化情况。21天后处死各组小鼠,称小鼠体重,剥取瘤块,分别称瘤重,计算实验组抑瘤率,作移植瘤病理组织切片。取小鼠肺组织计算小鼠肺表面转移瘤结节数,计算实验组肺转移抑制率。作病理组织切片观察肺组织的病理改变。3、SABC免疫组化法检测各组Lewis肺癌移植瘤组织CD31蛋白的表达,计数各组荷瘤小鼠瘤组织微血管密度(MVD)。4、SABC免疫组化法检测各组Lewis肺癌移植瘤组织肿瘤转移相关分子(TF、MMP-2、VEGF、E-cad、CD44)蛋白水平的表达情况。第二部分体外细胞实验1、制备祛瘀化痰方、祛瘀方及化痰方的中药含药血清。体外培养人高转移性95-D细胞。2、MTT法检测祛瘀化痰方对人肺癌95-D细胞增殖的影响3、采用粘附分析实验检测祛瘀化痰方对人肺癌95-D细胞同质粘附、及其与人脐静脉内皮细胞异质粘附的影响。4、细胞划痕(Wound healing)实验检测祛瘀化痰方对人肺癌95-D细胞迁移的影响5、Transwell侵袭实验检测祛瘀化痰方对人肺癌95-D细胞侵袭的影响6、实时荧光定量PCR法检测祛瘀化痰方对人肺癌95-D细胞肿瘤转移相关分子(TF、MMP-2、VEGF、E-cad、CD44) mRNA表达的影响结果：第一部分体内动物实验1、各组小鼠体重变化：除顺铂组外其他各组小鼠体重均逐渐增加。而顺铂组总体趋势是体重逐渐下降后有上升趋势,但到实验结束时,体重仍没能回到实验开始时的体重。2、各组小鼠移植瘤体积变化：顺铂组的移植瘤体积增长最慢,祛瘀化痰高剂量组次之,生理盐水对照组的移植瘤体积增长最快。3、各实验组的抑瘤率：祛瘀化痰方高、低剂量组分别为38.02%、24.11%,祛瘀方高、低剂量组分别为19.28%、14.25%,化痰方高、低剂量组分别为10.74%、4.96%。且表现出一定的剂量依赖性。顺铂组的抑瘤率为59.22%。4、各实验组的肺转移抑制率：祛瘀化痰方高、低剂量组的肺转移抑制率分别为39.77%、29.25%；化痰高、低剂量组的肺转移抑制率分别为20.92%、16.42%；且呈一定的量效关系。祛瘀高、低剂量组的肺转移抑制率分别是：11.91%、20.69%。5、各实验组的小鼠移植瘤组织微血管的影响：祛瘀化痰方高、低剂量组,祛瘀方高剂量组和化痰方高剂量组有一定的抑制血管生成的作用。但祛瘀方低剂量组和化痰方低级量组却没有显示明显抑制肿瘤血管生成的作用。6、各实验组移植瘤组织肿瘤转移相关分子(TF、MMP-2、VEGF、 E-cad、CD44)蛋白水平表达：祛瘀化痰方高低剂量组均可升高Lewis肺癌移植瘤组织E-cadherin蛋白的表达而降低CD44、MMP-2、VEGF、TF蛋白的表达。祛瘀方高、低剂量组主要能降低Lewis肺癌移植瘤组织TF、MMP-2、VEGF蛋白的表达。而化痰方高、低剂量组主要能升高E-cadherin蛋白的表达而降低CD44蛋白的表达。第二部分体外细胞实验1、各实验组对95-D细胞的增殖抑制率：祛瘀化痰方高、低剂量组分别是：31.49%(24h)、36.35%(48h)和25.32%(24h)、28.14%(48h)；祛瘀方高、低剂量组分别是：15.98%(24h)、21.96%(48h)和10.60%(24h)、19.72%(48h)；化痰方高、低剂量组分别是：4.43%(24h)、10.34%(48h)和0.79%(24h)、7.36%(48h)；2、各实验组对95-D细胞同质粘附的影响：祛瘀化痰方低剂量组、化痰方高剂量组促进95-D细胞同质黏附(P<0.05)；祛瘀方高剂量组可降低95-D细胞同质黏附(P<0.05)。3、各实验组对95-D细胞异质粘附的影响：祛瘀化痰方高、低剂量组、祛瘀方高、低剂量组及化痰方高、低剂量组均可抑制95-D与HUVEC的黏附(P<0.05),且存在一定的量效关系。祛瘀化痰方高低剂量组较祛瘀方和化痰方组抑制粘附作用更强。4、各实验组对95-D细胞迁移运动的影响：祛瘀化痰方高、低剂量组、祛瘀高剂量组及化痰方高剂量组均能抑制95-D细胞的迁移运动(P<0.05,P<0.01)。5、各实验组对95-D细胞侵袭能力的影响：祛瘀化痰方高低剂量组、祛瘀低剂量组、化痰高低剂量组均能够抑制95-D的侵袭能力(P<0.05,P<0.01)。6、各实验组对95-D细胞肿瘤转移相关基因(TF、MMP-2、VEGF、 E-cad、CD44)转录水平的影响：1)、祛瘀化痰方高剂量组、祛瘀方高剂量组及化痰方高剂量组均可抑制95-D细胞TF mRNA的表达(P<0.01)。化痰方低剂量组能促进95-D细胞TF mRNA的表达(P<0.01)。2)、祛瘀化痰方高剂量组和祛瘀方低剂量组可以抑制95-D细胞MMP-2mRNA的表达(P<0.01)。祛瘀方高剂量组可以促进95-D细胞MMP-2mRNA的表达(P<0.01)。3)、祛瘀化痰方高、低剂量组、祛瘀方高、低剂量组及化痰方高、低剂量组均抑制95-D细胞VEGF mRNA的表达(P<0.01)。且存在一定的一定剂量依赖性。4)、祛瘀化痰方高、低剂量组、祛瘀方高、低剂量组及化痰方高、低剂量组均促进95-D细胞E-cad mRNA的表达(P<0.01)。但各方低剂量组作用较高剂量组明显。5)、祛瘀化痰方低剂量组、祛瘀方低剂量组、化痰方低剂量组均促进95-D细胞CD44mRNA的表达(P<0.01)。祛瘀化痰方高剂量组能抑制95-D细胞CD44mRNA的表达(P<0.01)。结论：1、祛瘀化痰方可抑制肺癌的生长和转移,对肺癌转移的关键环节：肿瘤细胞增殖、肿瘤细胞黏附、细胞外基质降解、肿瘤细胞迁移和侵袭、肿瘤血管生成等均有不同程度的作用。2、祛瘀方和化痰方在抗肺癌转移过程中并非作用于每一个肿瘤转移环节,不同方剂可能作用于不同的肿瘤转移环节,且同一方剂在不同肿瘤转移环节发挥作用不同,在有的环节可能是抑制转移,而在有的环节却可能是促进转移。但祛瘀化痰方整体上是抑制肺癌的生长和转移。3、祛瘀化痰法抗肺癌转移作用机制可能在于影响肺癌细胞TFMMP-2、VEGF、E-cad、CD44蛋白合成和基因转录两个水平的表达,进而影响肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移和侵袭,以及影响细胞外基质的降解和肿瘤血管的生成。祛瘀化痰法从多步骤、多环节、多靶点抑制肺癌转移。4、肺癌血瘀证的实质可能为肺癌细胞异常表达的TF、VEGF、MMP-2所形成的分子网络。5、肺癌痰证的实质可能是肺癌细胞异常表达的E-cad、CD44等粘附分子形成的分子网络。