背景及研究目的:机体通过免疫应答进行免疫反应是一种主动防御方式。孕期时胎儿在母体内顺利的生长发育也是母体免疫系统产生耐受的一个复杂调控方式,受到免疫活性细胞和其他细胞因子等多种因素影响和调控。关于妊娠免疫耐受的机制目前有很多研究,比如有研究表明Fas/Fasl在妊娠免疫耐受中发挥重要作用。以Th1和Th2两型免疫反应为主导的母胎界面的局部免疫调控也对胚胎的免疫耐受起着不容忽视的调节作用。细胞、细胞因子及细胞外基质之间构成相互作用的复杂网路,形成了母-胎界面上特有的免疫耐受状态,以维持正常妊娠。母胎免疫耐受平衡的调节使胚胎不被母体免疫系统所排斥,一旦这种平衡关系失调,母体免疫系统就可能会攻击已形成的胚胎,便导致病理性妊娠疾病,如胚胎停止发育、复发性流产（recurrent spontaneous abortion,RSA）等。胎儿作为半同种异体抗原,在妊娠过程中如何逃避母体免疫系统攻击而不被排斥,到目前为止仍未被完全阐述清楚。吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）是一种细胞内的含亚铁血红素酶,是肝脏以外唯一可沿犬尿酸途径使色氨酸分解代谢,从而催化吲哚环氧化裂解的限速酶。在人体中,约90%的色氨酸由IDO沿犬尿酸途径降解。IDO是分解色氨酸,沿犬尿氨酸通路代谢的限速酶,通过耗竭色氨酸及产生犬尿氨酸等生物活性物质,调节T细胞、NK细胞等介导的免疫反应,发挥免疫调节作用。Munn等发现IDO抑制剂处理的孕鼠能迅速引起针对同种异基因孕体的排斥反应。进一步的研究发现这种排斥反应系由T细胞激活炎症反应,致补体C3沉积所致。由于T细胞是母胎耐受和维持妊娠的调控器,IDO是通过影响T细胞而防止母胎排斥反应的关键因素。研究表明,妊娠时胎盘滋养细胞产生的IDO能够抑制母体T淋巴细胞反应,从而保护胎儿对抗母体的排斥反应,可见正常的IDO表达和活性是维持妊娠所必需的。IDO在正常妊娠免疫耐受中发挥重要免疫调节功能,是维持正常妊娠,防止胎儿发生免疫排斥的关键因素。在妊娠期,母胎界面存在辅助T细胞1（Th1）型/辅助T细胞2（Th2）型细胞因子的平衡与偏倚。妊娠早期,平衡向辅助Th2型偏倚,维持正常妊娠及母胎耐受。Th2型细胞因子,包括IL-4、IL-10等,参与B细胞的增殖、分化、成熟及促进抗体的生成,增强体液免疫应答。在妊娠期,由于母胎界面Th2型细胞因子占优势,IL-10（Th2型细胞因子）的表达相对较高。IL-10是一种重要的多效免疫调节细胞因子,是有抗炎性质的最重要的细胞因子之一。IL-10具有抑制Thl型细胞因子合成的能力,并参与了 Th2免疫应答。通过调节Th/Th2平衡影响局部的免疫环境,使胚胎不会被母体所排斥,在维持母胎界面抗炎和促炎环境的平衡起着关键的作用。细胞因子信号抑制物（Suppressors of cytokine signaling,SOCS）是一类负性调节细胞因子信号的蛋白家族,其中SOCS3为抑制细胞因子信号的关键因子。SOCS3在胎盘组织中高表达并参与胎儿细胞增殖、分化,调控胎盘、胎儿正常发育,对滋养层分化起着关键的调节作用,是胎盘正常发育所必需的因子。进一步研究发现,SOCS3通过对白血病抑制因子受体（LIFR）信号的负反馈调节,抑制滋养层干细胞分化成巨细胞并促进海绵滋养细胞的形成。近年研究表明,SOCS3与Th1和Th2细胞分化、失衡有关,SOCS3优势表达于Th2细胞,抑制Th1分化。Ito等研究表明:IL-10可通过诱导SOCS3来抑制IFN-γ信号通路中STAT1依赖性的IP-10、ISG54等基因表达,进而促进Th1/Th2平衡,向Th2偏移。提示SOCS3可能参与调节IL-10信号通路及Th1/Th2平衡。先前的研究表明,在IDO/IL-10双缺陷小鼠中,IDO基因缺陷小鼠免疫活性明显减弱,IDO的活性是通过抑制IL-10来维持自身的免疫潜能。有研究也显示IL-10信号转导可以通过JAK/STAT3途径,上调SOCS3的表达,而SOCS3可以反馈抑制IL-10/STAT3信号途径,从而调控信号转导。但IL-10对早孕母胎界面IDO的调节机制尚不完全明确。需要更多的实验及临床研究来明确IDO在免疫调节中的真正作用及机制。对IDO代谢性免疫调节功能及机制的进一步研究,对IDO活性的调控,将有可能成为控制炎症感染、诱导同种异体移植物耐受、诱导和维持母胎免疫耐受的一种有效手段,而IL-10对IDO在母胎界面的调节的相关机制研究,也将为母胎界面免疫耐受提供依据及治疗手段提供新的思路。方法:1.通过免疫组织化学法和western blot法检测早孕绒毛及蜕膜组织中IDO和SOCS3的表达水平。用不同浓度（10ng/ml,100ng/ml,1000 ng/ml）的孕酮处理绒毛和蜕膜组织48h,然后通过western blot法检测IDO和SOCS3的表达水平。2.用不同浓度（10ng/ml,50ng/ml和100ng/ml）孕酮抑制剂米非司酮处理早孕绒毛及蜕膜组织24h后,通过western blot法检测IDO和SOCS3的表达水平。分离新鲜的绒毛和蜕膜组织,加入100ng/ml的孕酮培养进行培养,分别在12h时收集培养的上清,用酶联免疫吸附双抗体夹心法（ELISA）检测INF-γ、TNF-α、IL-4和IL-10的含量。在孕酮处理的绒毛组织培养液中添加抗IL-10的抗体,Western blot检测绒毛组织中IDO和SOCS3的表达情况。3.在绒毛和蜕膜组织中,用不同浓度的（0.1 ng/ml,1 ng/ml,10 ng/ml）IL-10处理后,荧光定量PCR和Western blot检测二者组织中的IDO和SOCS3的mRNA和蛋白的表达情况,然后对绒毛和蜕膜组织IDO和SOCS3的表达情况进行Pearson相关性分析,分析二者的相关性。用10,100和1000 ng/ml的IL-10处理早孕绒毛及蜕膜组织,然后用Western blot检测组织中IDO和SOCS3蛋白表达水平。再用10 ng/ml IL-10处理早孕绒毛及蜕膜组织不同时间（6h,12h,24h）,Western blot检测早孕绒毛及蜕膜组织中IDO和SOCS3蛋白表达水平。4.在绒毛组织中,用浓度分别为（1 ng/ml和10 ng/ml）IL-10处理,Western blot检测JAK/STAT3通路中关键蛋白的变化,如磷酸化JAK,总的JAK、磷酸化STAT3和总的STAT3的表达。此外,我们进一步通过人绒毛滋养层细胞（HTR-8）研究不同浓度IL-10对JAK/STAT3通路的影响。通过分离细胞核蛋白和细胞质蛋白,Western blot检测IL-10对STAT3在细胞核和细胞质的影响。通过细胞免疫荧光观察IL-10对STAT3在细胞核和细胞质的定位情况,并用STAT3的活性抑制剂（STX-0119）进行验证。5.用电泳迁移率实验（EMSA）检测磷酸化STAT3蛋白分子与SOCS3启动子DNA序列的结合作用,染色质免疫共沉淀（ChIP）检测磷酸化STAT3是否和SOCS3启动子序列结合。6.用蛋白质磷酸化激酶芯片（含有37种不同的激酶和2种相关的总蛋白）进行细胞信号通路的初步筛选IL-10可能影响信号通路。进一步用1ng/ml和10 ng/ml的IL-10处理滋养层细胞,然后添加STAT3的抑制剂（STX-0119）后,Western blot检测SOCS3和IDO的表达情况。用蛋白酶降解的抑制剂（MG132）处理后,Western blot检测SOCS3与IDO之间的负调控关系是否通过蛋白酶降解系统来执行。结果:1.免疫组织化学染色结果显示:IDO主要定位在细胞核中,其在蜕膜组织中的表达量显著高于绒毛组织中（P＜0.05）;SOCS3主要定位于细胞质中,其在蜕膜组织中的表达量与绒毛组织差异不明显（P＞0.05）。Western blot进一步对蜕膜与绒毛组中IDO和SOCS3的表达水平检测,结果显示:IDO在绒毛中的表达比蜕膜中表达弱,差异有统计学意义（P＜0.05）,而SOCS3在绒毛、蜕膜中表达差异不明显,差异无统计学意义（P＞0.05）。2.Western blot检测显示:在绒毛组织中低浓度（10 ng/ml）孕酮对IDO和SOCS3的表达没有显著的影响,但是随着浓度的增加,100ng/ml和1000ng/ml的孕酮能显著抑制IDO的表达,100ng/ml和1000ng/ml的孕酮能显著促进SOCS3的表达,其中100ng/ml的促进作用最为显著。在蜕膜组织中低浓度（10 ng/ml）孕酮对IDO和SOCS3的表达没有显著的影响,100ng/ml和1000ng/ml的孕酮能显著抑制IDO的表达,这种抑制作用具有一定的浓度依赖性,而100ng/ml和1000ng/ml的孕酮能显著促进SOCS3的表达,其中1000ng/ml的促进作用最为显著,这种促进作用具有一定的浓度依赖性。孕酮抑制剂能阻断孕酮对早孕绒毛及蜕膜组织中IDO和SOCS3表达影响。3.酶联免疫吸附双抗体夹心法（ELISA）检测结果显示,孕酮抑制绒毛组织中INF-γ和TNF-α的分泌,而促进蜕膜组织中TNF-α的分泌,抑制INF-γ的分泌（P＜0.05）。此外,孕酮能促进绒毛组织和蜕膜组织中IL-10和IL-4的分泌（P＜0.05）。添加10ng/ml抗IL-10的抗体后对IDO的表达没有显著影响,随着浓度的增加到20ng/ml时,抗IL-10的抗体明显阻断孕酮对IDO表达的抑制作用（P＜0.05）;添加10ng/ml抗IL-10的抗体后能抑制孕酮对SOCS3表达的促进作用,随着浓度增加到20ng/ml时抗IL-10的抗体能显著阻断孕酮对SOCS3的促进作用（P＜0.05）。上述实验结果提示,在绒毛组织中孕酮可能是通过刺激组织中的滋养层细胞或/和其他细胞（免疫细胞）分泌IL-10,分泌的IL-10通过旁分泌或自分泌的方式调控绒毛组织中IDO和SOCS3的表达。4.0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml的IL-10处理绒毛组织和蜕膜组织后,能显著增加SOCS3的mRNA表达水平,抑制IDO的mRNA表达水平（P＜0.05）,影响的强弱与浓度有关,1Ong/ml的IL-10影响最显著（P＜0.01）。且在绒毛和蜕膜组织中SOCS3和DIO的表达显著负相关,绒毛组织中Pearson相关系数为-0.74（P＜0.05）,蜕膜组织中的Pearson相关系数为-0.76（P＜0.05）,进一步通过Western blot检测结果显示在绒毛组织中,10ng/ml IL-10后能抑制IDO的表达,并能促进SOCS3的表达,随着IL-10浓度的增加这种促进作用具有浓度依赖性。在蜕膜组织中,10ng/ml IL-10后能抑制IDO的表达,随着IL-10浓度的增加这种抑制作用逐渐减弱,此外SOCS3的表达水平随着IL-10浓度的增加而增加,具有一定的浓度依赖性。在绒毛组织中,IDO和SOCS3表达的Pearson相关系数为-0.808（P＜0.05）。在蜕膜组织中IDO和SOCS3表达的Pearson相关系数为-0.855（P＜0.05）。这表明经过IL-10处理后的绒毛和蜕膜组织中IDO和SOCS3的表达具有高度负相关性。5.Western blot检测结果:在绒毛组织中,加入10ng/ml IL-10后能抑制IDO的表达（P＜0.05）,但随着IL-10浓度的增加这种抑制作用逐渐减弱。而10ng/ml的IL-10能显著促进SOCS3的表达,随着IL-10浓度的增加这种促进并没有浓度依赖性。在蜕膜组织中,10ng/ml IL-10后能抑制IDO的表达（P＜0.05）,随着IL-10浓度的增加这种抑制作用逐渐减弱。而1Ong/ml的IL-10后对能促进SOCS3的表达,随着IL-10浓度的增加这种促进作用没有显著改变。进一步研究显示在绒毛组织中,10 ng/ml IL-10在12h时能发挥显著的生物学功能,即抑制IDO的表达而促进SOCS3的表达（P＜0.05）。在蜕膜组织中,10 ng/ml IL-10在12h时能发挥显著的生物学功能,即抑制IDO的表达而促进SOCS3的表达。6.用蛋白质磷酸化激酶芯片（含有37种不同的激酶和2种相关的总蛋白）进行细胞信号通路的初步筛选,发现IL-10能显著影响增加STAT3的磷酸化水平。进一步用浓度（1 ng/ml和10 ng/ml）IL-10处理后,与Control组相比,磷酸化的JAK（p-JAK）表达水平显著升高,而对总的JAK的表达没有显著影响,磷酸化的STAT3（p-STAT3）表达水平显著升高（P＜0.05）,而对总的STAT3的表达没有显著影响。此外,SOCS3的表达水平也随着磷酸化JAK和磷酸化STAT3表达水平的升高也显著升高。分离细胞质蛋白和细胞核蛋白,Western blot检测结果显示10 ng/ml的IL-10能显著促进滋养层细胞中STAT3的活化,促进其向细胞核进行转位,进而激活STAT3的下游靶基因,发挥生理调控作用（P＜0.05）。细胞免疫荧光显示10 ng/ml的IL-10能显著促进滋养层细胞中STAT3的活化,促进其向细胞核进行转位。7.Western blot检测结果显示不同浓度的STAT3的抑制剂（STX-0119）,25μM和50μM后能显著抑制磷酸化STAT3的水平,同时SOCS3的表达水平也相应的降低。电泳迁移率实验（EMSA）和染色质免疫共沉淀（Chip）检测结果显示IL-10能促进磷酸化STAT3与细胞核内SOCS3启动子区的结合。此外,添加10 ng/ml IL-10能显著抑制IDO的表达水平,与10 ng/ml IL-10单独处理组相比,添加蛋白酶抑制剂（100μMMG132）后,能显著阻断IL-10降低IDO表达的效应。结论:1.IDO在蜕膜组织中比绒毛组织中表达更高,SOCS3在绒毛组织与蜕膜组织中表达无明显差异。孕酮可能通过刺激滋养层细胞分泌IL-10,再通过旁分泌或自分泌方式调节IDO和SOCS3的表达。2.IL-10通过激活JAK/SAT3/SOCS3信号通路,导致磷酸化STAT3向细胞核转位,活化后的STAT3能结合到SOCS3启动子区,进而促进SOCS3的表达、抑制IDO的表达。3.IDO与SOCS3之间的负调控关系是通过蛋白酶降解系统来执行,即高表达SOCS3能和IDO结合形成SOCS3/IDO蛋白复合体,该蛋白复合体通过泛素化途径进行蛋白的降解。