研究背景植骨融合在脊柱疾患的手术治疗中是最常用的手术方法之一,腰椎手术的成败与融合的成败休戚相关。自体骨植骨融合是融合的金标准。在美国,每年有将近五十万病人因为脊柱或者骨折而通过目前融合手术来缓解严重的腰痛或骨折不愈合翻修来促进愈合而接受治疗。在这些手术中脊柱手术占了1/2。在进行各种脊柱融合手术或明显骨缺损的骨折治疗时,往往在术中需要进行植骨。面对自体骨,同种异体骨,DBM等形形色色备选植骨材料,究竟为病人选择哪种植骨材料是临床脊柱外科医生一直面临的一个困惑。使用自体骨植骨融合已获广大学者的公认,尽管目前有很多种异体骨,但始终不可能完全取代自体骨,自体骨植骨有很多优点等(如费用低廉,无免疫排斥性等),但是自体骨植骨同时也带来了很多问题,如自体骨移植出现的不融合率在逐年增加,由此可导致邻近节段退变、不稳、假关节形成等。如何提高脊柱融合率已成为当前研究的热点。甲状旁腺素(parathyroid hormone, PTH)是甲状旁腺分泌的一种激素,主要调节机体的钙磷代谢及骨代谢。大量研究证实,甲状旁腺激素及其片段和类似物具有直接和强有力的刺激骨生长作用,尤其在小梁骨丰富的脊柱、骨质疏松的患者。各年龄人群的骨折修复和宇航员失重造成的骨丢失者中均显示出理想的疗效。椎骨和非椎骨骨折的发生率均下降。目前国外已开发的PTH类似物有两种,分别为美国Lilly公司采用大肠杆菌表达系统成功开发的rhPTH(1-34)和Allelix公司运用蛋白酶缺失的大肠杆菌表达系统,并对天然PTH的基本序列改造成功研发的rhPTH(1-84)。PTH类似物特立帕肤(teriparatide)是由美国礼来(Lilly)公司开发,已于2002年在美国、奥地利、丹麦、芬兰、德国、希腊、冰岛、爱尔兰、荷兰、挪威、葡萄牙、瑞士上市,并于2003年和2004年在英国和澳大利亚相继上市,是目前唯一治疗骨质疏松症的药物。特立帕肽为人甲状旁腺激素类似物,通过与细胞表面受体特异性地高亲和力结合来介导,增加成骨细胞的活性及数量而促进骨的形成,而应用于骨质疏松症及预防骨质疏松性骨折的治疗,它具有与天然甲状旁腺激素(PTH)N端34个氨基酸序列相同的结构,它可以与PTH-1受体结合,发挥PTH对骨骼与肾脏的生理作用；同时不存在C端肽对骨代谢的不利影响。研究表明该药可以促进骨形成,增加骨密度,降低骨折风险,并可与其他治疗骨质疏松症药物联合应用增强疗效。Anastasilakis等[1]对22例绝经后骨质疏松症妇女分别应用特立帕肽20 u g·d-1与每周利塞膦酸钠35mg,在开始治疗前、治疗后第3个月、第6个月观察骨转换指标改变,1年后停用药物。研究发现,反映骨形成相关指标如血清碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原N端前肽(PNP)在特立帕肽组明显增加(P<0.001),而在利塞膦酸钠组明显下降(P<0.001)；反映骨吸收指标血清Ⅰ型胶原C端肽(CTX)在特立帕肽组也增加,而在利塞膦酸钠组下降,提示特立帕肽独特具有促进骨形成与骨吸收的双重作用。目前原发性骨质疏松症常规治疗药物如双膦酸盐、降钙素、雌激素类,其作用机制均是通过抑制破骨细胞活性达到治疗骨质疏松症效果,而特立帕肽是目前唯一认为具有促进骨合成代谢的药物。单独或联合应用特立帕肽,可以增加骨密度、改善骨微结构、降低骨折风险。Lilly’s公司对1637名患骨质疏松症-相关骨折的绝经后妇女的Ⅲ期临床试验结果表明,rhPTH(1-34)具有显著降低病人患中度或严重脊椎骨折危险率及非脊椎骨折危险率的明显疗效。PTH对于患骨质疏松症的大鼠和人不但能刺激骨形成而且还能增加骨质量和强度。因灵长类动物骨重建和结构与人骨相似,所以灵长类动物逐渐被应用到实验中,研究证实,连续6个月每天皮下注射重组人PTH(rhPTH)(1-34),能够增加卵巢切除猴的脊椎骨矿物质密度,不影响血清离子化钙水平或尿钙排泄。这是目前第一个被批准具有促骨形成的药物,因而受到各国的特别关注。hPTH(1-34)是骨形成药物,通过增加成骨细胞数及(或)其活力来促进新骨生长。间歇性应用PTH有较强的成骨作用但作用机制尚不完全清楚。目前主要有以下观点：抑制成骨细胞凋亡；促进成骨母细胞与成骨细胞的增生与分化,此过程可能与核结合因子有关；促进骨衬里细胞向成骨细胞转化；调节成骨细胞自分泌与旁分泌。PTH具有很强的成骨作用,现在已有大量的文献报道小剂量hPTH(1-34)能够增加全身BMD,治疗骨质疏松。hPTH(1-34)对脊柱融合率的影响,也有文献报道能够提高融合率,增加融合区的骨量。已经证实hPTH(1-34)主要是通过激活PTH1R受体,从而激活了几个信号转导通路,包括cAMP/PKA、NonPLC/PKC和PLC/PKC等。经研究证明PLC/PKC促进骨代谢转换,促进骨吸收。PTH的临床应用复杂而且本身具有促骨合成和促骨吸收作用,如何避免其促骨吸收发挥其促骨合成作用是目前来研究的热点之一。通过设计PTH信号选择性模拟肽从而单一刺激某一PTH的信号通路是一条重要的研究途径。G1,R19(1-34)和G1,R19(1-28)是基于hPTH的改建肽。YangD等证实了G1,R19(1-34)不能激活PLC/PKC信号途径,可通过PTH1R受体激活cAMP/PKA信号和NonPLC/PKC信号通路,可增加全身BMD和促进骨松质形成,改善其微结构；并证实间断小剂量G1,R19(1-34)在对成骨细胞的促分化和松质骨的促合成作用上优于hPTH(1-34),理论上因不刺激PLC通路(研究证明PLC促进骨代谢转换,促进骨吸收)更加合理。研究目的1、通过建立大鼠脊柱融合模型,研究三种信号选择性PTH模拟肽全身使用对大鼠脊柱融合以及骨量的影响。分析研究PTH通过非PLC信号通路影响移植骨愈合的机制。2、阐明PTH通过不同信号转导通路对自体骨脊柱融合的影响,为PTH(1-34)及其信号选择模拟肽在脊柱外科的临床应用提供理论依据。为临床促进脊柱融合提供实验依据,并为下一步临床实验和PTH相关药物设计奠定基础。研究方法32只纯种健康雄性SD大鼠(动物,麻醉及抗菌素用药均由南方医科大学动物中心提供),平均重220g,周龄8周,3%戊巴比妥腹腔注射麻醉,所有动物均行后外侧路脊柱融合术,术后随机分成四组,每组8只。G1,R19(1-28)组——皮下注射G1,R19(1-28)(200μg/kg), hPTH(1-34)组——皮下注射hPTH(1-34)组(15μg/kg),G1,R19(1-34)组——皮下注射G1,R19(1-34)组(30μg/kg),对照组——皮下注射适量生理盐水。分笼饲养,采用颗粒营养饲料喂养,自由饮水,同等采光通风条件。术后第四天各组采用上述方法分别开始肩胛下区皮下注射,每天1次,每周5天,共6周。术后6周分别行手法触诊检查融合节段的活动度、融合节段X线进行评分、融合节段BMD和BMC、Micro-CT和组织学观察。结果手法触诊：G1,R19(1-28)组、hPTH(1-34)组、G1,R19(1-34)组和对照组融合率分别达到37.5%、50%、87.5%和50%；X线评分系统(“0”=无骨形成,“5”=完全融合)在G1,R19(1-28)组、hPTH(1-34)组、G1,R19(1-34)组和对照组分别为(1.8750±1.3562)分、(2.8333±1.3101)分、(3.8750±0.7546)分和(2.5417±1.3206)分,四组之间统计学差异显著(x2=8.850,P=0.031),平均秩次分别为10.69、16.56、24.13和14.63；离体融合节段BMD四组之间统计学差异显著(F=9.136,P=0.000),从均值上看,G1,R19(1-34)组高于其他三组,和G1,R19(1-28)组间统计学差异显著(P=0.001),和hPTH(1-34)组(P=0.524)及对照组(P=1.000)的差异没有统计学意义,hPTH(1-34)组和G1,R19(1-28)组统计学差异不显著(P=0.056),hPTH(1-34)组和对照组差异不显著(P=0.600),G1,R19(1-28)组明显低于对照组统计学差异显著(P=0.001)。离体融合节段BMC四组之间统计学差异显著(F=22.353,P=0.000),经统计检验,G1,R19(1-34)组高于hPTH(1-34)组(P=0.008)、G1,R19(1-28)组(P=0.000)和对照组(P=0.000),hPTH(1-34)组高于对照组(P=0.001),hPTH(1-34)组和G1,R19(1-28)组差异没有统计学意义(P=0.430),G1,R19(1-28)组和对照组差异没有统计学意义(P=0.112)；Micro-CT扫描后分析融合区体积,结果显示四组间统计学差异显著(x2=8.031,P=0.045)。G’,R19(1-28)组、hPTH(1-34)组、G1,R19(1-34)组和对照组组分别为290.233±49.201mm3、343.356±106.742mm3、401.008±97.116mm3和339.789±44.198mmm3,平均秩次分别为9.13、16.75、22.13和18.00；6周后对所有样本进行组织学观察。G’,R19(1-34)组和hPTH(1-34)组可见骨小梁分布规则,髓腔完全再通,而对照组骨小梁较厚排列紊乱,髓腔未完全再通,G’,R19(1-28)组大部分髓腔未相通,同时还可见大量的未吸收的移植骨碎片。G1,R19(1-34)组和hPTH(1-34)组还可见大量的软骨细胞；对照组和G1,R19(1-28)组较少见到软骨细胞,虽然可以看到一些新骨形成,但生长较慢,在一些骨不连区域,大量胶原纤维样组织出现。结论1、间断皮下注射G1,R19(1-34)能够增加大鼠后外侧路脊柱融合率及融合区的体积,且比hPTH(1-34)更为显著；再次证实了G1,R19(1-34)不能激活PLC/PKC信号途径,可通过PTH1R受体激活cAMP/PKA信号和NonPLC/PKC信号通路,增加全身BMD和促进骨松质形成,改善其微结构。并证实间断小剂量G1,R19(1-34)在对成骨细胞的促分化和松质骨的促合成作用上优于hPTH(1-34),理论上因不刺激PLC通路(研究证明PLC促进骨代谢转换,促进骨吸收)更加合理。为临床上选用G1,R19(1-34)片段提供了实验依据。2、从手法触诊、X线评价、融合节段BMD和BMC、MicroCT、组织学观察来看,G1,R19(1-28)抑制了大鼠的脊柱融合；这说明抑制了NONPLC/PKC信号通路,则抑制了骨的再生及重建,从而抑制了脊柱融合。