围术期神经认知功能障碍小鼠海马miR-320-3p表达的变化

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目的:第一部分:通过对正常小鼠海马组织与患有围术期神经认知功能障碍(perioperative neurocognitive disorders,PND)的小鼠海马组织进行基因测序,观察PND小鼠海马组织mi RNA的表达谱变化,筛选差异表达的mi RNA,通过生物信息分析预测对应的靶基因及其相关功能。第二部分:评估PND小鼠海马内mi R-320-3p的表达变化。方法:选择12-14周龄、体重20-25g、雄性C57/BL6小鼠,第一部分:选取小鼠6只,随机分为2组(n=3),分别是对照组(Con)与实验组(Exp)。实验组小鼠在异氟醚麻醉下通过胫骨骨折内固定手术建立PND小鼠模型。并在术前和术后第3d行Morris水迷宫实验和旷场实验,分别记录小鼠水迷宫逃避潜伏期、靶象限停留时间百分比和旷场运动总路程,评估其空间记忆和自主活动能力。于术后3d行为学实验结束后,处死取海马组织,用于高通量基因测序,对所获得的差异mi RNA进行差异聚类分析、靶基因预测(mi Randa,Targetscan)、靶基因功能分析(GO)、信号通路富集分析(KEGG)等生物信息分析。第二部分:选取小鼠90只,随机分为3组(n=30),分别是正常对照组(C组)、吸入麻醉组(A组)、麻醉手术组(S组)。正常对照组不做任何处理,吸入麻醉组持续异氟醚麻醉15min,麻醉手术组于异氟醚麻醉下行胫骨骨折髓内钉固定手术。并在术前和术后第1、3、7d行Morris水迷宫实验和旷场实验,分别记录小鼠水迷宫逃避潜伏期、靶象限停留时间百分比和旷场运动总路程,评估其空间记忆和自主活动能力。于术后1、3、7d行为学实验结束后,处死取海马组织,用q RT-PCR检测mi R-320-3p与IGF-1mRNA,western blot检测IGF-1。结果:第一部分:(1)Morris水迷宫与旷场实验显示与Con组相比Exp组在术后3d逃避潜伏期延长、靶象限停留时间百分比降低(P<0.05),两组小鼠运动总路程无统计学差异(P>0.05)。(2)高通量基因测序将两组数据进行差异筛选,得到7个差异表达的mi RNA,其中mmu-mi R-320-3p、mmu-mi R-6236、mmu-mi R-6239、mmu-mi R-676-3p、mmu-mi R-1298-5p、mmu-mi R-344d-3p表达均升高,mmu-mi R-380-3p表达降低;经Target Scan与mi Randa数据库预测的交集靶基因结果为783个;在GO靶基因功能富集分析中,差异基因显著性功能主要富集于转录激活因子活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸活性、突触结构成分、轴突生成、mRNA分解代谢过程等;基于KEGG数据库,对目标基因参与的Pathway进行显著性分析,分析显示差异基因主要富集于MAPK信号通路、RAS信号通路、m TOR信号通路、胰岛素信号通路以及神经营养因子信号通路等。第二部分:(1)Morris水迷宫与旷场实验显示,与C组相比,S组在术后1、3、7d逃避潜伏期延长、靶象限停留时间百分比降低(P<0.05);与C组相比A组无明显统计学差异(P>0.05);三组小鼠运动总路程无统计学差异(P>0.05)。(2)q RT-PCR检测mi R-320-3p与IGF-1mRNA,与C组相比,S组术后1、3d mi R-320-3p表达升高,术后1、3、7d IGF-1mRNA表达均降低(P<0.05)。与C组相比A组无明显统计学差异(P>0.05)。(3)western blot检测IGF-1蛋白,与C组相比,S组在术后1d IGF-1蛋白表达降低(P<0.05),术后3、7d差异无统计学意义(P>0.05)。与C组相比A组无统计学差异(P>0.05)。结论:(1)PND小鼠海马组织内包括mi R-320-3p在内共7个mi RNA存在显著差异表达。(2)通过生物信息学分析,提示差异mi RNA可能通过MAPK、RAS、m TOR、神经营养因子以及胰岛素等数个信号通路参与与PND疾病进展,为PND发病机制的探究提供更多研究方向。(3)q RT-PCR验证相关RNA(mi RNA-320-3p、IGF-1 mRNA)的变化与生物信息分析结果一致,证明了测序结果的可靠性并并推测mi R-320-3p可能通过靶向调节IGF-1 mRNA参与PND疾病的发生与发展。
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