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食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂,是美国科学家Stephen J.Gardell于1989年从南美洲吸血蝙蝠Desmodus rotundus的唾液中分离获得,是一种组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)类似物。该类似物共有四种形式,分别为:DSPAa1、DSPAa2、DSPAβ、DSPAγ。其中,DSPAa含有指形(Finger)区、表皮生长因子(E,与hEGF相似)区、kringle(K)区和丝氨酸蛋白酶(P)区,DSPAβ含E、K、P区,DSPAγ只有K和P区。所有的DSPA都只有单链形式,具有酰胺水解活性,对纤溶酶原的激活严格要求血纤蛋白作为辅助因子,否则不能激活纤溶酶原。其中DSPAa1已在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞、转基因烟草、巴斯德毕赤酵母中得到表达,DSPAa2已在大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母中得到表达,DSPAγ已在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中得到表达。研究发现,同t-PA相比,DSPAa1的血纤蛋白依赖性和选择特异性更高,当血纤蛋白存在时,DSPAa1的催化速率将提高105倍,而t-PA仅提高550倍。DSPAa2的纤溶活性较DSPAa1低。DSPAγ具有溶栓能力,但其作用大大低于DSPAa1,即Finger和EGF区的缺失大大降低DSPAa1的活性,即结构的改变显著影响溶栓作用。为此,分别构建了缺失E区的DSPAa1突变体和缺失F区的DSPAβ以及缺失E区和F区的突变体DSPAγ,目的是进一步研究DSPA结构与功能的关系,确定DSPA纤溶活性的必需结构域,为新药的研发提供一定的理论依据。
本课题首先运用小片段引物合成和片段拼接等技术,人工合成包括缺失E区的DSPAa1(简称mDSPAa1)、DSPAβ和DSPAγ并克隆到表达载体pPIC9K上；成功构建出mDSPAa1/pPIC9K、DSPAB/pPIC9K和DSPAγ/pPIC9K重组质粒。然后,将构建的重组质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,mDSPAa1经过G418浓度梯度抗性筛选、小量表达后经SDS-PAGE电泳检测获得一高表达菌株,目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的30％以上,目的蛋白的分泌量大约为30mg/L。DSPAβ小量表达后经SDS-PAGE电泳检测获得一高表达菌株。对酵母工程菌mDSPAa1/GS115及DSPAβ/GS115进行大量表达,通过甲醇诱导分泌型表达重组蛋白mDSPAa1、DSPAβ,经过72 h诱导表达,离心,收集上清,65％硫酸铵沉淀,透析后,纤维平板法对其进行活性测定。以尿激酶为标准品,经测定DSPAa1活性为2.64x105U/mg,mDSPAa1活性为151.52 U/mg,DSPAβ的活性为1.32x104 U/mg。结果表明E区的缺失几乎使DSPAa1丧失纤溶酶活,说明E区在DSPAa1溶栓过程中起着至关重要的作用。