成花是绝大多数高等植物生活史中一个重要的由营养生长向生殖生长逐渐发育的复杂的分子生理生化平衡调控过程,它不仅关系到物种繁衍,也是人类食品的重要来源.植物成花分子机理已在拟南芥、金鱼草等模式植物上取得了长足进展和重大突破,其中TFL1/CEN、LFY/FLO、AP1/SQUA同源基因是调控植物花序、花及花器官原基分化与发育的3个关键性基因,而且不同种类植物中这3个异型基因的同源基因在序列特征、表达模式和功能上既具有较高的保守性,也表现出不同程度的差异性.木本果树成花分子机理的研究十分落后,而枇杷中这3个同源基因的表达与功能分析尚未见报道,为此,本研究以基因克隆、Northern杂交和转基因技术为主要手段,对枇杷成花3个关键基因EJTFL1、EJLFY、EJAP1的表达与功能等方面进行了初步研究,希望为揭示枇杷成花分子机理奠定基础,并为生产实践中缩短枇杷童期、加速育种进程和促进枇杷早花早果、早上市提供理论依据。主要结果如下： 1、改进了枇杷总RNA提取方法,使得能更有效去除叶芽和早期花芽中存在的大量粘多糖,使RNA产率提高上十倍,并易于把握,为后续Northern杂交中需用不同时期大量的RNA奠定了基础。 2、从枇杷“早钟6号"品种中克隆了EJTFL1-1,1-2基因的cDNA大片段(510bp/169aa和493bp/163aa)、EJTFL1-2 gDNA大片段(3 145bp)和EJTFL1-1gDNA全长(3214bp),序列比对与分析表明,EJTFL1-1与.EJTFL1-2cDNA全长序列与GenBank上日本学者登录的相应基因各只有3个碱基差异,二者氨基酸同源率为90％;EJTFL1-1和EJTFL1-2 gDNA皆包含了长度几乎等同的3段内含子和4段外显子,二者核苷酸同源率为92.2％,其差异碱基遍布整个基因,推测是由同一个基因的2个拷贝进化而来,并且是已登录植物TFL1同源基因中序列最长的基因,主要原因是包含了一个长达2443bp的内含子,据此可为枇杷与其他物种亲缘关系的鉴定提供依据。 3、首次应用Northern杂交技术对枇杷成花相关同源基因EJTFL1、EdLFY和EJAP1的时空表达特性进行了研究,结果表明：EJTFL1-1与EJTFL1-2几乎具有一致的表达模式,二者都在较早期叶芽到花芽形态分化后的单花芽膨大期存在着较强烈且稳定的表达,但EJTFL1-2比EJTFL1-1起止表达时间稍早,这表明EJTFLl在枇杷叶芽向花芽起始转变和花芽形态建成过程中发挥着重要作用;EJLFY在晚期叶芽到花芽形态分化期呈现由弱渐强的表达特点,再到花序中小花蕾绽放稍前期呈现持续强烈地表达,开花后迅速消失,这表明EJLFY在促进叶芽向花序芽的成熟发育过程中发挥着重要作用;EJAP1在花芽形态分化初期开始微弱表达,从穗状花序芽到盛花期间都表现出长期强烈而稳定的表达活性,在花谢时表达迅速减弱,此外EJAP1还在萼片、雄蕊、花瓣和幼果中存在着表达,且表达强度依次显著降低,这表明EJAP1对枇杷单花芽、花序芽和花器官原基的分化与成熟发育具有重要促进作用.另外,连续两年的重复实验还发现侧梢项芽中EJLFY和EJAP1比主枝顶芽中相应基因的表达高峰期约提早2周左右出现.这些结果也为揭示上述3个同源基因之间的相互作用关系提供了依据。 4、构建了pBI121-EJAP1植物表达载体,并通过对烟草的遗传转化培养获得了转EJAP1烟草植株.在此过程中,对烟草遗传转化体系进行了进一步优化,因而有效地提高了烟草转化后不定芽成苗率和基因转化频率,并降低了组织污染率。 5、对获得的转EJLFY和EJAP1烟草植株运用PCR、Southern blot、RT-PCR、Northern blot等技术进行检测,结果表明:2个外源基因已整合到几株转基因烟草中,并在转录水平上发生了表达,但通过开花期表型鉴定却发现转EJLFY烟草植株全部并没有比未转化烟草提早开花,而转EJAP1烟草植株,在观察日结束时有1株比对照株显著提前24d开花,另有1株的生长高度也超过了对照株.结合相关文献分析,我们认为枇杷EJLFY与烟草NFL同源基因有着较大的分子功能或基因调控机理上的差异,而EJAP1与烟草NAP1之间则比较保守。 6、对枇杷EJLFY和EJAP1基因的原核表达进行了初探:构建了原核表达载体pET30a (+)-EJLFY和pET30a(+)-EJAP1,并将二者转入原核大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达,但SDS-PAGE电泳检测表明并未获得2个目的基因的蛋白产物,对导致的可能原因进行了深入分析并提出了改进策略。