本论文对畜牧业中广泛使用的典型兽药进行了调研,监测了养殖场和基地种植区土壤及畜禽粪污水中典型兽药的污染水平和分布,并对污染残留具代表性的强力霉素(Doxycycline,DOX)开展了环境污染和安全性评价研究。分别从检测方法的建立和强力霉素在粪便中吸附、解吸和降解行为与植物修复、粪源强力霉素暴露对水培叶菜和生殖细胞的安全性影响等方面,系统研究了强力霉素在养殖粪污和种植环境中的污染特征,在动物粪便中的吸附、解吸和降解行为与植物修复,以及环境浓度水平下对水培叶菜和雄性生殖细胞的安全性影响。1养殖场和产地环境土壤中典型兽药的污染监测 本研究选择规模化畜禽养殖场和蔬菜种植基地,对施用粪肥的土壤样品进行采集和分析,研究环丙氨嗪、四环素类、磺胺类、喹诺酮类和氟苯尼考等养殖业兽药对土壤污染,并对典型兽药品种四环素类开展长期监测。结果表明,养殖场种植区表层(0～20cm)土壤、亚表层(20～40cm)土壤和深层(40～60cm)土壤中,超过80%的样品被五类十三种兽药污染,在土壤中残留由高至低依次为:环丙氨嗪>四环素类>磺胺类>喹诺酮类>氟苯尼考;对同一区域的养殖场种植区土壤(0～20cm)开展长期监测,发现四环素类抗生素是土壤药物污染的一类主要抗生素,这与研究区养殖业中普遍施用该类抗生素及在土壤环境中较为稳定有关;动物粪便的施用是养殖场和基地种植区土壤中兽药污染的重要来源,对其进行必要的处理是减免农田土壤抗生素污染的有效途径。2规模化畜禽养殖场粪便和污水中强力霉素及其他三种四环素类抗生素的污染监测根据土壤监测的结果,选择典型四环素类抗生素,进一步研究其在粪污中的污染特征。本研究采集了规模化养殖场(猪场和鸡场)堆肥场粪便28份和排污口污水28份,研究畜禽粪污中强力霉素和土霉素、金霉素及四环素的污染水平、分布情况。结果显示:四环素类抗生素在粪便和污水样品中有高的检出率,粪便样品中检出率均高于68%,污水样品中除四环素外其他三种检出率均高于75%;强力霉素和土霉素残留浓度,在粪便中是mg/kg水平,分别为0.03～20.60mg/kg和0.01～31.60mg/kg,在污水中是μg/L水平,分别为0.59～220.96μg/L和0.32～876.21dg/L,高于四环素和金霉素的残留浓度;从检出率和残留量中值分析,猪场和鸡场的粪便与污水中四种抗生素的污染相似,表明他们在养殖场使用普遍,但猪场生产粪污尤其是污水生产量大,对水环境污染严重来源,生产中需要加强对猪场用药的指导和监督。根据对养殖场和产地环境土壤及畜禽粪污中兽药污染监测结果,选择典型兽药强力霉素,进一步开展安全性评价研究。3养殖污水中强力霉素残留的HPLC方法的研究建立 本研究建立了养殖污水中强力霉素残留检测的高效液相色谱(HPLC)检测方法,用于后续安全性评价研究中吸附和富集实验中污水样品的测定。样品离心后取上清液过滤膜,调pH值后经过弱阳离子固相萃取柱萃取净化,水浴氮气吹近干,C18色谱柱分离,流动相为0.01mol/L乙二酸溶液和甲醇与乙腈等比混合液,在比例为65:35中洗脱,350nm波长下进行测定。强力霉素在1～20.0μg/mL浓度范围内,标准曲线呈线性相关,相关系数r为0.9998;在10.0～50.0μg/L浓度添加范围内,强力霉素平均回收率为91.55%～95.14%,日内相对标准偏差为1.66%～6.45%,日间相对标准偏差为0.62%～0.75%,方法的检测限为0.1μg/mL,定量限为1 μg/mL。该方法操作简便、回收率和灵敏度高。4粪便和叶菜中强力霉素残留的固相萃取HPLC-MS/MS检测方法的建立 本研究同时建立了粪便和叶菜中强力霉素残留的固相萃取-液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测方法,用于后续安全性评价研究中降解和吸附实验中粪便样品的测定,及富集实█验中叶菜样品的测定。用Mcllvaine缓冲溶液(pH=4.0)对粪便样品进行提取,用甲醇和Mcllvaine缓冲溶液(比例为9:1,pH=6.0)对青菜样品进行提取,提取液用固相萃取柱净化后在水浴氮气吹近干,C18色谱柱分离,用甲醇和0.1%甲酸溶液按照60:40比例混合洗脱,使用电喷雾正离子源在多反应监测模式下测定。标准曲线在20～1000ng/mL浓度范围内呈线性相关,相关系数r为0.9999;在50～500ng/g的添加浓度范围内,粪便样品中平均回收率为66.42%～81.93%,日内相对标准偏差为4.85%～7.29%,日间相对标准偏差为2.23%～2.43%;青菜样品中平均回收率72.16%～88.64%,日内相对标准偏差为3.51%～6.87%,日间相对标准偏差为1.44%～1.82%。方法检测限和定量限分别为5.0 ng/g(mL)和50.0 ng/g(mL),满足样品检测的要求。5强力霉素在禽粪便中的降解动态及影响因素研究 试验以肉鸡排泄物中的强力霉素为研究对象,研究了药物浓度、光照和微生物等因素对强力霉素降解动态的影响,探讨粪便中强力霉素的主要降解机制和影响因素。结果表明:鸡粪中强力霉素降解动态符合一级动力学降解方程,降解速度与药物残留初始浓度呈负相关,其残留浓度越高,降解越慢,在粪便中越不易消除;反之,容易被降解和去除。在避光条件下,灭菌组强力霉素降解半衰期为140.28d,未灭菌组降解半衰期为69.27d,在未灭菌光照条件下,强力霉素降解半衰期为36.87d,各处理组间降解半衰期差异极显著(P<0.01),表明光解和微生物降解是粪便中强力霉素降解的主要方式。6强力霉素在禽粪便上的吸附特征研究 通过批处理平衡试验,研究了强力霉素在鸡排泄物中的吸附和解吸附行为及机制,以及pH和离子类型与强度等因素对解吸附的影响。结果表明:强力霉素容易被鸡粪快速吸附,达到平衡时吸附率在90%,吸附特性符合Freundlich方程;强力霉素在鸡粪上具有析出特性,解吸附能力与溶液pH和离子强度有关,在pH<6时,pH越小,解吸附能力增强且差异显著(P<0.05),pH≥6时,解吸附能力几乎没有变化,表明强力霉素在酸性条件下能被解吸出来,即在南方酸雨等自然因素作用下,堆肥或者施入农田的含有强力霉的粪肥能解吸附;在低离子强度下,二价Ca2+的解吸附能力强于Na+和K+,但未形成显著性差异;而在高离子强度下,强力霉素的解吸附能力也会随之增强,即环境中NO3-和Ca2+强度较高时,对鸡粪中强力霉素解吸附作用差异极显著(P<0.01),因此通过淋溶作用移到外界环境的风险较大。7强力霉素暴露污染对水培叶菜吸收与累积影响研究 通过水培试验,比较了四种消费蔬菜在强力霉素胁迫下的吸收量和富集系数的变化,研究了强力霉素在培养溶液中的去除规律,评价了污染蔬菜的食用安全性及抗生素环境污染的植物修复。结果表明:强力霉素在有蔬菜的培养液中的降解速度明显快于无蔬菜种植的培养液,在空白对照组的培养液中去除了 37.8%,而在绿罗莎、苦苣、绿箭和绿直立四种叶菜的培养液中的去除率超过95%,去除半衰期分别为22.1、1.4、1.5、2.3和2.8d,与对照组相比差异极显著(P<0.01);在吸收富集能力上,绿罗莎和苦苣对强力霉素的富集系数(BCF)分别为7.20和4.95,BCF值均大于1,属于超富集品种,符合积累机制,易产生食品安全问题,适用于受到抗生素污染环境的植物修复,而绿箭和绿直立对强力霉素的BCF分别为0.76和0.49,属于低积累植物品种,符合外排机制,可用于修复时的套种。8强力霉素暴露污染对生殖细胞活性和毒性效应研究 以小鼠睾丸间质瘤细胞(mLTC-1)为研究对象,以强力霉素为受试物,研究强力霉素对生殖细胞孕酮合成和分泌的影响及作用机制。在细胞培养试验中,通过MTT法和Annexin V-FITC/PI法研究不同浓度强力霉素对mLTC-1细胞活力影响,确定受试物的试验浓度;通过对cAMP/PKA通路上性激素结合位点及其各关键控制点刺激,揭示强力霉素对mLTC-1细胞孕酮合成途径影响,并运用2D胶方法,进一步分析强力霉素对mLTC-1细胞蛋白变化的影响。结果表明,强力霉素浓度高于20μM浓度时能显著降低mLTC-1细胞活力(P<0.05),增加细胞凋亡水平,在10μM浓度时,对细胞活力和凋亡水平无显著影响,但对mLTC-1细胞合成孕酮产生明显抑制作用(P<0.05),该作用与hCG或forskolin刺激mLTC-1中cAMP表达没有显著相关性,与细胞核DNA编码的StAR、P450scc、3w-HSD基因表达关系也不明显,可能在线粒体位点抑制睾酮合成。通过2D胶进一步分析结果表明,强力霉素刺激mLCT-1细胞中HSP60、GRP75、IVD、HCDH蛋白上调,这些蛋白与线粒体应激相关,说明强力霉素通过引起mLCT-1细胞线粒体功能改变来抑制孕酮合成,进而抑制睾酮分泌,具有影响雄性生殖健康的潜力威胁。