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植物病毒病是对植物危害最严重的病害，其中烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯Y病毒（PVY）和黄瓜花叶病毒（CMV）是几种对农作物危害最严重的病毒。目前，防控这三种植物病毒病的主要方法依然是使用化学合成农药，而高毒、高污染和高残留的农药的使用给环境和人类的健康造成了极大的危害。糖是一种具有广泛生物活性的碳水化合物，在医药和农药领域具有广阔的发展前景，是目前研究的一大热点。糖类农药与传统合成农药相比，具有无毒、无污染和无残留等优点。金钗石斛是一种兰科石斛属植物，是珍贵的中药材，目前已有某些文献报道金钗石斛多糖具有增强免疫、抗肿瘤和抗氧化等医药活性。然而，它在农药方面的活性却未见报道。鉴于金钗石斛的医药活性，本研究尝试探索其抗植物病害的活性情况。研究开展的具体过程与内容如下：
1.采用水提法从金钗石斛中提取金钗石斛粗提物（W）。用乙酸乙酯和正丁醇依次对粗糖进行萃取。水层经过乙醇沉淀、Sevag试剂除蛋白、活性炭脱色和透析获得精制粗多糖（DNP）。其后采用阴离子交换柱对该精制粗多糖进行分离，获得六个流分，分别为E1、E2、E3、E4、E5和E6；其中E4和E6再经凝胶色谱柱分离纯化，获得11个均一性的多糖DNPE4(2)、DNPE4(4)、DNPE4(7)、DNPE6(1)、DNPE6(4)、DNPE6(5)、DNPE6(6)、DNPE6(7)、DNPE6(8)、DNPE6(9)和DNPE6(11)。采用高效凝胶色谱法对此11个多糖的纯度和分子量进行分析，采用傅立叶变换红外光谱、紫外可见分光光度法和质谱对这11个多糖进行表征，采用单糖组成分析、甲基化分析、高碘酸氧化——Smith降解和部分酸水解等化学方法对此11个多糖的一级结构进行分析。
2.以TMV、CMV和PVY为研究对象，采用半叶枯斑法，对W的抗病毒活性进行了测试，结果发现当浓度为500μg/mL时，W抗CMV保护和治疗活性分别为57.6%和57.0%，均优于比对照药剂宁南霉素（保护活性：54.3%，治疗活性：55.1%）。当浓度为500μg/mL时，W抗PVY保护活性为54.1%，优于对照药剂宁南霉素（51.4%）。基于此结果，对W进一步分离纯化，并对分离获得的多糖进行了抗TMV、CMV和PVY活性测试，结果发现：
①在500μg/mL的浓度下，粗多糖E2对TMV的保护活性为64.3%，与对照药剂宁南霉素（62.1%）相当；多糖E1对TMV的钝化活性为93.0%，与对照药剂宁南霉素（90.0%）相当。当测试浓度为125μg/mL时，结果显示DNPE4(7)、DNPE6(4)、DNPE6(5)、DNPE6(6)和DNPE6(9)抗TMV保护活性分别为59.3%、69.9%、65.2%、57.0%和66.0%，优于宁南霉素（54.9%）、氨基寡糖（39.1%）和香菇多糖（52.3%）。另外，结果显示DNPE4(2)、DNPE4(4)、DNPE4(7)和DNPE6(8)抗TMV治疗活性分别为50.7%、51.4%、52.3%和52.3%，优于宁南霉素（33.6%）、氨基寡糖（17.2%）和香菇多糖（48.8%）。
②在500μg/mL的浓度下，粗多糖E6抗CMV保护活性为43.9%，与氨基寡糖（45.1%）和香菇多糖（43.0%）相当。粗多糖E3和E4抗CMV治疗活性分别为40.2%和50.2%，均优于氨基寡糖（37.3%）和香菇多糖（37.8%）。粗多糖E2、E3和E6抗CMV的钝化活性为49.7%、49.9%和54.5%，均优于对照药剂氨基寡糖（34.1%）和香菇多糖（46.7%）。粗多糖DNPE4(3)和均一性多糖DNPE6(1)对CMV的治疗活性分别为42.2%和39.3%，优于对照药剂氨基寡糖（37.3%）和香菇多糖（37.8%），均一性多糖NPPE6(11)对CMV的治疗活性为55.1%，优于氨基寡糖（37.3%）和香菇多糖（37.8%）。粗多糖DNPE4(5)和DNPE6(3)，以及均一性多糖DNPE6(8)对CMV钝化活性分别为35.6%、35.4%和38.0%，与氨基寡糖（34.1%）相当；均一性多糖DNPE4(7)和DNPE6(6)，以及粗多糖DNPE4(3)对CMV钝化活性分别为43.1%、45.7%和46.8%，优于氨基寡糖（34.1%），与香菇多糖相当（46.7%）；粗多糖DNPE4(1)和均一性多糖DNPE6(11)对CMV钝化活性分别为60.6%和58.2%，均优于氨基寡糖（34.1%）和香菇多糖（46.7%）。
③在500μg/mL的浓度下，多糖DNPE6(11)对PVY的治疗活性为51.5%，与对照药剂宁南霉素（50.8%）相当。多糖DNPE6(2)和DNPE6(3)对PVY的钝化活性为62.4%和63.6%，优于对照药剂宁南霉素（60.7%）。
3.基于DNPE6(11)对CMV具有良好的钝化活性，采用荧光光谱和微量热泳动法对DNPE6(11)与CMV CP的之间的结合力进行分析，结果表明DNPE6(11)、与CMV CP的结合常数Ka和电离常数Kd分别为1.45×105L/mol和18.1±6.4μM该结果显示多糖DNPE6(11)与CMV CP存在很强的结合力，说明DNPE6(11)可以通过与CMV CP结合以抑制病毒对植物的侵染。另外，基于DNPE6(4)抗TMV良好的保护活性，对DNPE6(4)处理后的烟草中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性进行测试，结果发现DNPE6(4)可以提高烟草中SOD、POD和PAL的活性以增强烟草抵御病害的能力。并且对DNPE6(4)处理后的烟草中的防御基因SOD和过氧化氢酶-1（CAT1）的表达量进行检测，结果发现DNPE6(4)可以不同程度的使这两个防御基因的表达量上调，该结果与防御酶活性测试的结果基本一致，这说明DNPE6(4)可以使防御基因SOD和CAT1的表达量上调，并且使防御酶SOD、POD和PAL活性增强，从而使烟草抵御病害的能力增强。另外，采用蛋白组学方法对CK+TMV组和TMV+DNPE6(4)组的差异蛋白质进行了分析，并且进行了GO term和KEGG分析，结果发现DNPE6(4)可以使NADPH氧化酶和NAD(P)H上调，使一些CaM亚型（Calmodulin NtCaM11、Calmodulin NtCaM1、Centrin(probable calcium-binding protein CML20)和calcium-binding allergen Ole e8-like）上调，以及一些病程相关蛋白和防御酶（Thaumatin-like protein(pathogenesis-related protein R major form)、Acidic endochitinaseQ(EC3.2.1.14)(Pathogenesis-related protein Q)(PR-Q)、pathogenesis-related protein STH-2-like和Peroxidase(EC1.11.1.7)）上调，结合实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）对水杨酸通路中关键基因Isochorismate synthase protein（ICS1）、Enhanceddisease susceptibility1（EDS1）和Pathogenesis-relatedprotein1（PR1）的表达量的分析结果，阐明了DNPE6(4)的作用通路，即DNPE6(4)能够作为一种激发子，触发钙离子信号通路，进而产生一系列相关的防御反应，增强烟草抵御TMV的能力。
1.采用水提法从金钗石斛中提取金钗石斛粗提物（W）。用乙酸乙酯和正丁醇依次对粗糖进行萃取。水层经过乙醇沉淀、Sevag试剂除蛋白、活性炭脱色和透析获得精制粗多糖（DNP）。其后采用阴离子交换柱对该精制粗多糖进行分离，获得六个流分，分别为E1、E2、E3、E4、E5和E6；其中E4和E6再经凝胶色谱柱分离纯化，获得11个均一性的多糖DNPE4(2)、DNPE4(4)、DNPE4(7)、DNPE6(1)、DNPE6(4)、DNPE6(5)、DNPE6(6)、DNPE6(7)、DNPE6(8)、DNPE6(9)和DNPE6(11)。采用高效凝胶色谱法对此11个多糖的纯度和分子量进行分析，采用傅立叶变换红外光谱、紫外可见分光光度法和质谱对这11个多糖进行表征，采用单糖组成分析、甲基化分析、高碘酸氧化——Smith降解和部分酸水解等化学方法对此11个多糖的一级结构进行分析。
2.以TMV、CMV和PVY为研究对象，采用半叶枯斑法，对W的抗病毒活性进行了测试，结果发现当浓度为500μg/mL时，W抗CMV保护和治疗活性分别为57.6%和57.0%，均优于比对照药剂宁南霉素（保护活性：54.3%，治疗活性：55.1%）。当浓度为500μg/mL时，W抗PVY保护活性为54.1%，优于对照药剂宁南霉素（51.4%）。基于此结果，对W进一步分离纯化，并对分离获得的多糖进行了抗TMV、CMV和PVY活性测试，结果发现：
①在500μg/mL的浓度下，粗多糖E2对TMV的保护活性为64.3%，与对照药剂宁南霉素（62.1%）相当；多糖E1对TMV的钝化活性为93.0%，与对照药剂宁南霉素（90.0%）相当。当测试浓度为125μg/mL时，结果显示DNPE4(7)、DNPE6(4)、DNPE6(5)、DNPE6(6)和DNPE6(9)抗TMV保护活性分别为59.3%、69.9%、65.2%、57.0%和66.0%，优于宁南霉素（54.9%）、氨基寡糖（39.1%）和香菇多糖（52.3%）。另外，结果显示DNPE4(2)、DNPE4(4)、DNPE4(7)和DNPE6(8)抗TMV治疗活性分别为50.7%、51.4%、52.3%和52.3%，优于宁南霉素（33.6%）、氨基寡糖（17.2%）和香菇多糖（48.8%）。
②在500μg/mL的浓度下，粗多糖E6抗CMV保护活性为43.9%，与氨基寡糖（45.1%）和香菇多糖（43.0%）相当。粗多糖E3和E4抗CMV治疗活性分别为40.2%和50.2%，均优于氨基寡糖（37.3%）和香菇多糖（37.8%）。粗多糖E2、E3和E6抗CMV的钝化活性为49.7%、49.9%和54.5%，均优于对照药剂氨基寡糖（34.1%）和香菇多糖（46.7%）。粗多糖DNPE4(3)和均一性多糖DNPE6(1)对CMV的治疗活性分别为42.2%和39.3%，优于对照药剂氨基寡糖（37.3%）和香菇多糖（37.8%），均一性多糖NPPE6(11)对CMV的治疗活性为55.1%，优于氨基寡糖（37.3%）和香菇多糖（37.8%）。粗多糖DNPE4(5)和DNPE6(3)，以及均一性多糖DNPE6(8)对CMV钝化活性分别为35.6%、35.4%和38.0%，与氨基寡糖（34.1%）相当；均一性多糖DNPE4(7)和DNPE6(6)，以及粗多糖DNPE4(3)对CMV钝化活性分别为43.1%、45.7%和46.8%，优于氨基寡糖（34.1%），与香菇多糖相当（46.7%）；粗多糖DNPE4(1)和均一性多糖DNPE6(11)对CMV钝化活性分别为60.6%和58.2%，均优于氨基寡糖（34.1%）和香菇多糖（46.7%）。
③在500μg/mL的浓度下，多糖DNPE6(11)对PVY的治疗活性为51.5%，与对照药剂宁南霉素（50.8%）相当。多糖DNPE6(2)和DNPE6(3)对PVY的钝化活性为62.4%和63.6%，优于对照药剂宁南霉素（60.7%）。
3.基于DNPE6(11)对CMV具有良好的钝化活性，采用荧光光谱和微量热泳动法对DNPE6(11)与CMV CP的之间的结合力进行分析，结果表明DNPE6(11)、与CMV CP的结合常数Ka和电离常数Kd分别为1.45×105L/mol和18.1±6.4μM该结果显示多糖DNPE6(11)与CMV CP存在很强的结合力，说明DNPE6(11)可以通过与CMV CP结合以抑制病毒对植物的侵染。另外，基于DNPE6(4)抗TMV良好的保护活性，对DNPE6(4)处理后的烟草中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性进行测试，结果发现DNPE6(4)可以提高烟草中SOD、POD和PAL的活性以增强烟草抵御病害的能力。并且对DNPE6(4)处理后的烟草中的防御基因SOD和过氧化氢酶-1（CAT1）的表达量进行检测，结果发现DNPE6(4)可以不同程度的使这两个防御基因的表达量上调，该结果与防御酶活性测试的结果基本一致，这说明DNPE6(4)可以使防御基因SOD和CAT1的表达量上调，并且使防御酶SOD、POD和PAL活性增强，从而使烟草抵御病害的能力增强。另外，采用蛋白组学方法对CK+TMV组和TMV+DNPE6(4)组的差异蛋白质进行了分析，并且进行了GO term和KEGG分析，结果发现DNPE6(4)可以使NADPH氧化酶和NAD(P)H上调，使一些CaM亚型（Calmodulin NtCaM11、Calmodulin NtCaM1、Centrin(probable calcium-binding protein CML20)和calcium-binding allergen Ole e8-like）上调，以及一些病程相关蛋白和防御酶（Thaumatin-like protein(pathogenesis-related protein R major form)、Acidic endochitinaseQ(EC3.2.1.14)(Pathogenesis-related protein Q)(PR-Q)、pathogenesis-related protein STH-2-like和Peroxidase(EC1.11.1.7)）上调，结合实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）对水杨酸通路中关键基因Isochorismate synthase protein（ICS1）、Enhanceddisease susceptibility1（EDS1）和Pathogenesis-relatedprotein1（PR1）的表达量的分析结果，阐明了DNPE6(4)的作用通路，即DNPE6(4)能够作为一种激发子，触发钙离子信号通路，进而产生一系列相关的防御反应，增强烟草抵御TMV的能力。