【摘 要】
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目的研究氚水对斑马鱼生长发育的辐射损伤效应,筛选氚水暴露后斑马鱼的差异表达基因,初步探讨氚水对水生动物的毒性机制。方法1.将斑马鱼胚胎分别暴露于浓度为3.7×103 Bq/ml、3.7×104 Bq/ml、3.7×105 Bq/ml的氚水中,建立氚水染毒模型,观察斑马鱼死亡率、畸形率、孵化率、自主运动、身长、心率及运动行为改变。2.收集斑马鱼在浓度为3.7×104 Bq/ml氚水中暴露60 h和1
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目的研究氚水对斑马鱼生长发育的辐射损伤效应,筛选氚水暴露后斑马鱼的差异表达基因,初步探讨氚水对水生动物的毒性机制。方法1.将斑马鱼胚胎分别暴露于浓度为3.7×103 Bq/ml、3.7×104 Bq/ml、3.7×105 Bq/ml的氚水中,建立氚水染毒模型,观察斑马鱼死亡率、畸形率、孵化率、自主运动、身长、心率及运动行为改变。2.收集斑马鱼在浓度为3.7×104 Bq/ml氚水中暴露60 h和120 h后的样本,进行RNA-seq转录组学检测,生物信息学分析RNA-seq结果,筛选差异表达基因。3.采用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒测定3.7×104 Bq/ml氚水暴露后斑马鱼甲状腺激素（总T3和总T4）含量,RT-PCR检测甲状腺相关基因表达水平。4.用RT-PCR实验检测TnC/TPM4通路相关基因（tnnc1a、tpm4a、tpm4b）在3.7×104 Bq/ml氚水暴露后的表达水平。5.CRISPR/Cas9技术建立tnnc1a、tpm4a基因敲除斑马鱼模型,并观察氚水染毒后心脏发育情况。结果1.斑马鱼胚胎暴露于不同浓度氚水后,斑马鱼胚胎无明显形态学改变,但在52 hpf时,氚水处理组的孵化率均显著下降;24 hpf斑马鱼自主运动能力下降;36、48、60hpf心率明显加快;在120hpf时,所有氚水处理组斑马鱼幼鱼的游泳活动、游泳速度和游泳总距离都显著下降。2.转录组检测结果显示,3.7×104Bq/ml氚水暴露60hpf时,共有134个差异表达基因,其中53个基因上调,81个基因下调;120 hpf时,共有433个差异表达基因,其中表达上调基因385个,下调基因48个。差异表达基因集中在生长发育过程和代谢过程。心率收缩关键基因tnnc1a、tpm4b在120hpf显著上调。3.甲状腺激素检测结果显示,在60 hpf时,氚水染毒组斑马鱼T3、T4含量显著上升;在120hpf时,T3、T4含量显著下降。120hpf时,氚水处理组斑马鱼tshβ和dio2 mRNA表达下调,ugt1ab和ttr mRNA表达上调。4.氚水暴露后,TnC/TPM4通路tnnc1a、tpm4a、tpm4b基因mRNA表达水平在36 hpf、48 hpf、60 hpf显著下调,在120 hpf显著上调。5.tnnc1a基因敲除后,氚水暴露组斑马鱼畸形率显著上升且心率显著下降;tpm4a基因敲除后氚水暴露组斑马鱼心率显著下降。结论氚水对斑马鱼生长发育有一定的毒性作用,表现为胚胎孵化能力下降,自主运动能力降低和游泳活动降低,以及明显的心率上升。3.7×104Bq/ml氚水暴露后,众多基因表达发生改变,差异表达基因集中在生长发育过程和代谢过程。氚水通过干扰斑马鱼甲状腺功能和影响TnC/TPM4通路引起心率改变。
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