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炎症、外伤等造成的牙髓损伤逐年增多,而现有的临床治疗方法还不能完全再造牙髓或代替牙髓组织的功能。牙髓细胞(Human Dental Plup Cells,h DPCs)是一种具有一定的自我增殖和分化潜力的细胞。以往研究已证实体外培养的牙髓细胞有形成钙化组织的能力,这种能力依赖于有多种生物学效应的细胞因子的调控,即细胞因子能够不同程度的刺激受损的牙髓细胞再生。结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)具有强烈促纤维化的作用,它可以增强牙髓细胞的矿化能力,但不能刺激牙髓细胞增殖,其中作用的分子机制尚不清楚。近年来发现酪氨酸蛋白激酶-信号转导子和转录激活子(Janus protein tyrosine kinase-Signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)通路与炎症反应、细胞增殖、分化等相关。本研究即探讨STAT3是否在CTGF刺激牙髓细胞增殖分化过程中起重要作用。第一部分CTGF在人牙髓细胞增殖、分化过程中的作用目的:体外培养h DPCs,观察CTGF对h DPCs增殖、分化的影响。方法:选取由于正畸或阻生拔除的健康、完整的第三磨牙(均经患者知情同意),在无菌条件下取出牙髓组织,采用组织酶消化法原代培养h DPCs并鉴定来源。采用不同浓度(0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)的CTGF作用于h DPCs,作用不同时间后,通过甲基噻唑基四唑(Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT)检测CTGF对h DPCs增殖的影响;茜素红染色观察矿化结节的形成。结果:1组织块酶解法能成功培养出成纤维样细胞,倒置显微镜下可见细胞形态均一,为典型的梭形,胞体丰满,胞浆丰富,细胞核呈圆形或卵圆形位于细胞中央,核仁清晰可见。免疫细胞化学染色结果示波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。2 MTT结果显示CTGF三个浓度(10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)均对细胞无毒性作用,能促进h DPCs增殖,且随着时间延长作用效果增强,第1天,实验组与对照组没有统计学意义(P>0.05),从第3天开始,实验组与对照组有统计学意义(P<0.05);茜素红结果显示CTGF组的矿化结节明显高于对照组。结论组织块酶解法能成功分离和培养出h DPCs;一定浓度的CTGF能够促进牙髓细胞增殖和分化。第二部分CTGF对人牙髓细胞中STAT3蛋白表达的影响目的:观察CTGF作用h DPCs后,细胞中STAT3蛋白的表达情况。方法:取第四代h DPCs制成细胞悬液,爬片后随机分为对照组、CTGF处理组、Stattic(STAT3特异性抑制剂)+CTGF处理组,分别培养30min后采用免疫组化SABC法检测中STAT3活性蛋白(磷酸化蛋白,Phos-STAT3)的表达情况。结果:h DPCs培养30 min后,CTGF处理组可见棕色颗粒主要分布在细胞核中,即Phos-STAT3主要在细胞核中表达;对照组相反,棕色颗粒主要分布在细胞质中,Phos-STAT3在胞质中表达,细胞核中无表达;Stattic+CTGF处理组细胞质中棕色颗粒比对照组明显减少,细胞核中无棕色颗粒,Phos-STAT3在细胞质中表达,但表达量比对照组降低。结论:CTGF能明显促进STAT3磷酸蛋白的表达,并诱导Phos-STAT3转移细胞核中表达;Stattic能抑制STAT3蛋白磷酸化。第三部分STAT3在CTGF诱导牙髓细胞分化中的作用目的:Stattic与CTGF联合作用h DPCs后,观察矿化结节以及ALP、OCN、OPN和DMP-1 m RNA表达水平。方法:取第4代人牙髓细胞制成细胞悬液,以104个/ml的浓度接种在6孔板和50 ml培养瓶中,细胞汇合后,将h DPCs随机分为空白对照组、阳性对照组(20ng/ml的CTGF)和实验组(STAT3抑制剂Stattic作用半小时后加入20ng/ml的CTGF),作用7 d、14 d、28 d后,采用茜素红染色观察矿化结节的形成,Real-time PCR法检ALP、OCN、OPN和DMP-1的m RNA表达水平。结果:茜素红结果:与阳性对照组相比,加入Stattic后,矿化结节形成明显减少。PCR结果显示:7天时,加入Stattic后,ALP、OCN、OPN和DMP-1的m RNA表达下降,CTGF组表达增高,差异有统计学意义(P<0.05);14天时,加入Stattic后,ALP m RNA表达下降,CTGF组表达增高,差异有统计学意义(P<0.05);Stattic组与对照组OCN m RNA表达无统计学意义(P>0.05),CTGF组的OCN m RNA表达增高,与其他两组比较有统计学意义(P<0.05);Stattic组与对照组OPN m RNA表达无统计学意义(P>0.05),CTGF组的OPN m RNA表达降低,较其他两组有统计学意义(P<0.05);DMP-1m RNA表达各组比对照组表达都降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:STAT3在CTGF诱导牙髓细胞分化中起重要作用。综上所述,CTGF能促进h DPCs增殖和分化,并且能够激活STAT3通路,使h DPCS中STAT3磷酸化蛋白表达增高,并促进Phos-STAT3转移到细胞核中。这一研究为揭示CTGF促进h DPCs分化的机制以及为临床开展新的牙髓炎症治疗方案提供了实验依据。