目的：　　糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy, DR)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)最常见的慢性并发症之一，是导致成年人致盲的常见眼病，其早期主要表现为视网膜神经胶质细胞尤其是Müller细胞的反应性增生（其活化的标志物是glial fibrillary acidic protein，GFAP，表达增加）、神经节细胞及感光细胞的丢失以及视网膜厚度减少等神经退行性病理改变。长期的高血糖刺激，可引起细胞内稳态的失衡，导致内质网腔内错误折叠蛋白累积或蛋白合成受阻，触发内质网应激的发生，从而激活凋亡相关信号通路，最终导致细胞凋亡。硫氧还蛋白（thioredoxin， Trx）是一个具有多种生物学功能的小分子蛋白，研究表明上调其表达可抑制凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1）的活化，有效抑制细胞凋亡。我们的前期研究发现，近年临床用于治疗成人2型糖尿病的新药—利拉鲁肽（Liraglutide，LIRA）可通过上调Trx表达，有效延迟糖尿病小鼠视网膜病变。因此，本论文拟建立糖尿病小鼠模型及高糖损伤的细胞模型，通过不同方法上调或下调Trx的表达及并通过使用ASK1抑制剂GS-4997下调ASK1的表达，研究Trx-ASK1在高糖所致神经细胞损伤中的作用机制，以期阐明糖尿病视网膜神经变性的机制，寻找影响其作用的靶点，为临床治疗糖尿病视网膜病变提供新的指导方向和科学依据。　　方法：　　1. 体内实验　　1.1. 建立糖尿病小鼠模型　　选用4周龄雄性Balb/c小鼠，通过链脲佐菌素(Streptozocin, STZ)及高脂饲料联合诱导2型糖尿病小鼠模型，以随机空腹血糖＞7.0mmol/L及出现胰岛素抵抗为建模成功。　　1.2. 实验分组　　1）为观察糖尿病不同时期小鼠视网膜组织及相关蛋白表达的情况，本组实验分为正常组（Control）、糖尿病10天组（DM，10d）、糖尿病20天组（DM, 20d）、糖尿病30天组(DM, 30d)。采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法观察视网膜组织形态并统计分析各核层厚度；免疫荧光对视网膜GFAP蛋白进行定位、定性；Western blot对相关蛋白进行检测。　　2）为观察Trx表达情况对糖尿病小鼠视网膜组织及相关蛋白表达的影响，通过LIRA上调Trx表达，Trx抑制剂PX12下调Trx表达，将本实验组分为：正常组（Control）、糖尿病模型组（DM）、糖尿病-利拉鲁肽处理组（DM+LIRA）、糖尿病-利拉鲁肽-PX12联合处理组（DM+LIRA+PX12)。实验检测方法同上。　　2. 体外实验：　　选用小鼠脑神经瘤（Neuro2a）细胞及人视网膜胶质（Müller）细胞作为研究对象，通过CCK8法检测:　　1）高糖（high glucose，HG）对Neuro2a和Müller细胞活性的影响，以筛选高糖损伤细胞模型的最佳作用浓度和时间，最终分别确定为30mM，24h和50mM，48h；　　2) 衣霉素（TM）对Neuro2a和Müller细胞活性的影响，以筛选TM诱导内质网应激的最佳作用浓度和时间，最终分别确定为20μg/ml，24h和20μg/ml，48h；　　3）LIRA对高糖状态下Neuro2a和Müller细胞活性的影响，以筛选LIRA的最佳保护浓度及作用时间，最终确定这两种细胞的LIRA作用条件均为100nM，6h；　　4）GS-4997对Neuro2a和Müller细胞活性的影响，筛选ASK1的最适抑制时间及浓度，结果确定分别为10μM，2h和10μM，6h。　　为研究Trx过表达时高糖诱导对Neuro2a和Müller细胞凋亡及内质网应激的影响，首先通过基因稳定转染的办法使Neuro2a和Müller细胞高表达Trx，进而将实验分为，空质粒LacZ对照组、LacZ+HG、Trx及Trx+HG组，之后通过流式细胞术及Western blot分别检测各组细胞的凋亡情况及相关蛋白表达情况。　　为研究RNA干扰（RNA interference, RNAi）下调Trx表达时，高糖诱导Neuro2a和Müller细胞凋亡及内质网应激的情况，首先采用RNAi下调Trx表达，在转染　　后的不同作用时间点，收集细胞提取蛋白，并用Western blot法检测Trx表达情况，最终确定Neuro2a和Müller细胞的最佳干扰时间分别为36h和48h，进而将本组实验分为Mock空白对照组、Mock+HG、RNAi及RNAi+HG组，之后通过流式细胞术及Western blot法分别检测各组细胞凋亡及相关蛋白表达情况。　　为研究Trx-ASK1介导内质网应激对高糖诱导Neuro2a细胞和Müller细胞凋亡的作用机制，我们首先采用LIRA及RNAi联合处理高糖状态下Neuro2a和Müller细胞的方式，将实验分为Control、HG、HG+LIRA、HG+LIRA+Mock及HG+LIRA+RNAi组，分别通过流式细胞术及Western blot法检测各组细胞凋亡及相关蛋白表达情况。随后，通过LIRA、RNAi及GS-4997联合处理高糖状态下Neuro2a细胞和Müller细胞，采用Western blot法检Control、HG、HG+LIRA、HG+LIRA+Mock及HG+LIRA+RNAi、HG+LIRA+RNAi+GS-4997各组相关蛋白的表达情况。　　结果：　　第一部分 糖尿病对小鼠视网膜神经组织的影响及机制初探　　视网膜HE染色结果显示：正常组小鼠视网膜各层结构清晰，细胞排列紧密整齐；糖尿病组小鼠视网膜各层结构清晰，但随着糖尿病病程的延长，视网膜细胞排列逐渐疏松，细胞间隙逐渐增大，尤以内核层和外核层最为显著。通过视网膜总厚度统计显示：与正常组比较，糖尿病小鼠视网膜总厚度在发病后第10天、第20天、第30天逐渐变薄，其中第20天和第30天具有显著性差异。　　组织免疫荧光法检测GFAP在小鼠视网膜中的表达及分布，结果显示：在正常对照组小鼠视网膜中，神经节细胞与神经纤维层分布有微弱的GFAP免疫荧光；而在糖尿病发病后第10天、第20天、第30天，小鼠视网膜GFAP荧光强度逐渐增加，并伴有长长的突起伸入内网层，与正常对照组比较有显著差异。　　Western blot检测视网膜Trx蛋白和GRP78蛋白的表达，结果显示：与正常对照组比较，糖尿病小鼠视网膜Trx的表达随着病程的延长逐渐降低，而GRP78的表达随着病程的延长逐渐增加。　　通过测量HE染色的DM小鼠视网膜总厚度、神经节细胞层厚度、内核层厚度及外核层厚度，结果发现：与DM组比较，LIRA可有效缓解DM小鼠视网膜总厚度、神经节细胞层厚度、内核层厚度及外核层厚度的减少；而与DM+LIRA组比较，LIRA与PX12联合应用时DM小鼠视网膜总厚度视网膜、神经节细胞层厚度、内核层厚度及外核层厚度均变薄。免疫荧光染色方法检测各实验组视网膜GFAP的表达情况，结果表明：与DM组比较，DM+LIRA组GFAP荧光强度明显削弱；与DM+LIRA组比较，HG+LIRA+PX12组GFAP荧光强度显著增强。　　Western blot法检测LIRA与PX12联合作用于糖尿病小鼠时视网膜Trx蛋白及GRP78蛋白的表达水平，结果显示：与DM组比较，给予LIRA治疗后，视网膜Trx蛋白表达水平显著增加，而GRP78蛋白表达水平则显著减少；与LIRA单独治疗组比较，LIRA与PX12联合处理组糖尿病小鼠后，视网膜Trx蛋白表达水平明显下调，而GRP78蛋白表达水平显著增加。　　第二部分 过表达Trx时高糖诱导对Neuro2a/Müller细胞内质网应激的影响　　Western blot法检TM及HG诱导Neuro2a和Müller细胞时Trx、ASK1及GRP78蛋白的表达情况，结果显示，与正常组比较，TM及HG诱导均可使Neuro2a和Müller细胞Trx蛋白表达水平显著下调，ASK1及GRP78蛋白表达水平显著上调。　　将pIRES2-EGFP-Trx和pIRES2-EGFP-LacZ质粒转染至Müller细胞，通过含有400μg/ml G418的培养基培养转染后的细胞，待pIRES2-EGFP质粒中的neo基因在细胞中表达，则G418失活，最终筛选出Müller-Trx和Müller-LacZ稳定转染细胞株。　　采用流式细胞术检测高糖处理时， Neuro2a-LacZ 组、Neuro2a-Trx 组及Müller-LacZ和Müller-Trx组细胞的凋亡情况，结果显示：与LacZ对照组比较， HG处理明显增加Neuro2a和Müller细胞LacZ组的细胞凋亡百分率；与Trx组比较，HG处理也明显增加了Neuro2a和Müller细胞Trx组的细胞凋亡百分率；在高糖条件下，Neuro2a和Müller细胞Trx 组的细胞凋亡百分率明显低于Neuro2a和Müller细胞LacZ组。　　Western blot法检测高糖处理后Neuro2a-LacZ、Neuro2a-Trx及Müller-LacZ、Müller-Trx细胞Trx、ASK1、GRP78、IRE1α、p-IRE1α和CHOP蛋白的表达情况，结果显示：与LacZ组比较，Neuro2a和Müller细胞Trx组Trx蛋白水平显著上调，而ASK1、GRP78、p-IRE1α、CHOP蛋白表达水平显著下调；经HG处理LacZ组后，Trx蛋白表达水平显著下调，而ASK1、GRP78、p-IRE1α、CHOP蛋白表达水平均显著上调；与Neuro2a和Müller细胞Trx组比较，经HG处理后，Trx蛋白表达水平显著下调，而ASK1、GRP78、p-IRE1α、CHOP蛋白表达水平则显著上调；其中，IRE1α蛋白表达水平在Neuro2a和Müller细胞各实验组无统计学差异。　　第三部分 下调Trx表达对高糖诱导的Neuro2a/Müller细胞凋亡及内质网应激的影响　　采用RNAi下调Trx表达，在转染后的不同作用时间点，收集细胞提取蛋白， Western Blot法检测Trx蛋白的表达，结果显示：　　(1) 与对照组比较，Neuro2a细胞Trx蛋白的表达水平分别在转染18h，24h，36h后均有统计学差异，且在36 h时Trx表达最低，因此，Neuro2a细胞的最佳干扰时间确定为36h；　　(2) 与对照组比较，Müller细胞Trx蛋白的表达水平在转染36h，48h后均有统计学差异，且48 h时Trx表达水平最低，因此，Müller细胞的最佳干扰时间确定为36h。　　流式细胞术检测RNAi下调Trx表达时高糖处理对Neuro2a及Müller细胞凋亡的影响，结果显示：与Mock组比较，RNAi组及HG+Mock处理组的Neuro2a和Müller细胞凋亡百分率均明显增加；而与RNAi组比较，经HG合并RNAi联合处理组的Neuro2a和Müller细胞凋亡百分率则增加更为显著。　　Western blot法检测RNAi下调Trx表达及HG处理Neuro2a及Müller细胞的Trx、ASK1、GRP78、IRE1α、p-IRE1α和CHOP蛋白表达情况，结果显示：与Mock组比较，RNAi组及HG+Mock处理组的Trx蛋白表达水平显著下调；而ASK1、GRP78、p-IRE1α、CHOP蛋白表达水平较RNAi组明显上调；与RNAi组比较，经HG合并RNAi联合处理组的Neuro2a和Müller细胞Trx蛋白表达水平显著下调，而ASK1、GRP78、p-IRE1α、CHOP蛋白表达水平则显著上调；其中，IRE1α蛋白表达水平在Neuro2a和Müller细胞各实验组无统计学差异。　　第四部分 Trx-ASK1介导内质网应激对高糖诱导Neuro2a和Müller细胞凋亡的作用机制　　流式细胞术检测LIRA和RNAi联合作用时高糖诱导Neuro2a和Müller细胞的凋亡，结果显示：与HG处理组比较，HG+LIRA处理组的Neuro2a和Müller细胞凋亡百分率明显下降；与 HG+LIRA 及 HG+LIRA+Mock 处理组比较， HG+LIRA+RNAi处理组的Neuro2a和Müller细胞凋亡百分率明显增加。　　Western blot法检测LIRA与RNAi联合作用时，高糖所诱导的Neuro2a和Müller细胞Trx、ASK1、GRP78、IRE1α、p-IRE1α和CHOP蛋白的表达。结果显示：与HG处理组比较，HG+LIRA组Neuro2a和Müller细胞Trx蛋白的表达水平明显上调，而ASK1、GRP78、p-IRE1α、CHOP蛋白表达水平明显下调；与HG+LIRA及HG+LIRA+Mock组比较，HG+LIRA+RNAi组Neuro2a和Müller细胞Trx蛋白的表达水平明显下调，而ASK1、GRP78、p-IRE1α、CHOP蛋白表达水平均明显上调；其中，IRE1α蛋白表达水平在Neuro2a和Müller细胞各实验组无统计学差异。　　Western blot法检测LIRA、RNAi与GS-4997联合处理高糖条件下的Neuro2a和Müller细胞时，Trx、ASK1、GRP78、IRE1α、p-IRE1α和CHOP蛋白的表达，结果显示：与HG+LIRA+RNAi组比较，HG+LIRA+RNAi+GS-4997组Neuro2a和Müller细胞Trx蛋白的表达水平显著增加，而ASK1、GRP78、p-IRE1α、CHOP蛋白表达水平则明显下调；其中，IRE1α蛋白表达水平在Neuro2a和Müller细胞各实验组无统计学差异。　　结论：　　1. 随着糖尿病病程的延长，Trx蛋白表达水平逐渐减少，GRP78蛋白表达水平逐渐增加，视网膜形态结构异常加剧。　　2. LIRA上调Trx蛋白表达，下调GRP78蛋白表达，改善糖尿病小鼠视网膜的形态异常。　　3. 高表达Trx竞争性抑制高糖诱导Neuro2a和Müller细胞Trx-ASK1的解离，减少ASK1的活化，从而抑制内质网应激介导的细胞凋亡。　　4. 下调Trx表达促进高糖诱导Neuro2a和Müller细胞Trx-ASK1的解离，增加了ASK1的活化，加剧了内质网应激介导的细胞凋亡。　　5. Trx-ASK1参与调控高糖诱导Neuro2a和Müller细胞内质网应激介导的细胞凋亡。