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前言：
越来越多的证据表明肥胖、代谢综合征(MS)与白蛋白尿以及慢性肾脏病密切相关。肥胖时存在几种病理生理紊乱:炎症、氧化应激、脂肪因子改变、胰岛素抵抗、肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活、巨噬细胞表型转换以及肾脏局部脂代谢异常,都能促进肾脏损伤。研究显示在肝脏、肌肉组织以及某些细胞系,持续活化AMP激活的蛋白激酶(AMPK)可以减少组织细胞中脂质沉积,减轻炎症及氧化损伤。有研究报道,二甲双胍可通过激活肝脏以及肌肉中AMPK,改善胰岛素抵抗。由此,我们推测二甲双胍可能通过激活肾脏AMPK减轻高脂饮食诱导的肥胖小鼠肾脏损伤。
目的：
观察高脂饮食C57BL/6J小鼠肾脏AMPK活性的变化及二甲双胍对高脂饮食诱导的肾脏损伤的改善作用。
方法：
6周龄的雄性C57BL/6J小鼠32只,随机分为2组:普通饮食组(ND),给予基础饲料喂养(15%能量由脂肪提供,n=8);高脂饮食组(HFD),给予高脂饲料喂养(59%能量由脂肪提供,n=24)。8周后根据体重将达到肥胖标准的HFD小鼠选出16只随机分成2组:高脂饮食组,继续给予高脂饮食(n=8);二甲双胍干预组(M),给予高脂饮食和二甲双胍(75mg·kg-1·d-1)灌胃(n=8)。继续喂养4周,应用体重及血生化指标对模型进行评价;Folch法提取肾脏脂质,酶法检测:光镜观察肾脏组织结构变化;Realtime-PCR检测肾皮质固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1c、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子(PGC)-1α、肿瘤坏死因子(TNF)-α、NADPH氧化酶(NOX)4mRNA表达;Westernblot法检测肾脏p-AMPKα蛋白表达;对数据进行单因素方差分析及相关性分析。
结果：
1、与ND组相比,HFD组小鼠体重(BW)明显增加(25.44±0.68gVS32.75±1.69g,P＜0.01),血甘油三酯(TG)和空腹血胰岛素(FINS)升高(0.42±0.04mmol/LVS0.84±0.41mmol/L,P＜D.05;8.92±3.31mU/LVS15.37±5.10mU/L,P＜0.05),胰岛素敏感指数(ISI)降低(11.23±3.90VS6.56±2.97,P＜0.05),血清高密度脂蛋白(HDL)明显减低(1.03±0.08mmol/LVS0.89±0.09mmol/L,P＜0.05)。与HFD组小鼠相比,M组小鼠BW、FINS降低(分别为:32.75±1.69gVS27.12±1.22g,P＜0.01:15.37±5.10mU/LVS9.31±3.62mU/L,P＜0.05),ISI和血HDL升高(分别为:6.56±2.97VS11.00±3.14,P＜0.05;0.89±0.09mmol/LVS1.01±0.10mmol/L,P＜0.05)。
2、与ND组相比,HFD组小鼠肾皮质TG含量明显增加(0.73±0.24mmol/LVS1.35±0.38mmol/L,P＜0.05),但胆固醇(TC)无明显改变,尿蛋白增多(0.98±0.27mg/24hVS2.02±0.58mg/24h,P＜0.01),油红O染色显示肾小球及小管明显的脂质沉积,Masson染色及HE染色显示高脂喂养的小鼠肾小球肥大、系膜细胞及系膜基质增生。与HFD组小鼠相比,M组小鼠肾脏甘油三酯含量及尿蛋白量明显减低(1.35±0.38mmol/LVS0.79±0.26mmol/L,P＜0.01;2.02±0.58mg/24hVS1.45±0.27mg/24h,P＜0.05),上述病理改变减轻。
3、与ND组相比,HFD组大鼠肾皮质p-AMPKα蛋白表达明显下调(0.23±0.10VS0.11±0.06,P＜0.05):TNF-α、NOX4、PGC-1αmRNA表达显著增加(分别为:2.55±0.84VS5.96±1.02,P＜0.01:6.96±4.57VS13.68±3.42,P＜0.05;3.75±0.43VS6.00±1.15,P＜0.05),SREBP-1mRNA表达未见明显改变(1.93±0.68VS1.60±0.20,P＞0.05)。与HFD组相比,M组经二甲双胍干预后小鼠肾皮质p-AMPKα蛋白表达增加(0.11±0.06VS0.21±0.06,P＜0.05);TNF-α、NOX4mRNA表达下调(分别为:5.96±1.02VS3.68±0.48,P＜0.01;13.68±3.42VS7.17±1.98,P＜0.05)。
4、相关性分析显示,HFD组和M组小鼠肾皮质p-AMPKα蛋白相对表达量与TNF-α、NOX4mRNA相对表达量及肾皮质TG含量、肾小球内径、尿蛋白量呈负相关(分别为:r=-0.807,P＜0.01;r=-0.537,P＜0.05;r=-0.922,P＜0.01;r=-0.613,P＜0.05;r=-0.573,P＜0.01)。
结论：
1.高脂喂养C57BL/6J小鼠12周后成功建立肥胖相关性肾病模型,具体表现为:肥胖、肾小球肥大以及蛋白尿。
2.二甲双胍治疗可改善肥胖小鼠代谢紊乱,增加肾脏AMPK活性,减少肾脏脂质积聚,减轻尿蛋白。
3.肥胖C57BL/6J小鼠肾脏AMPK活性减低,参与了肥胖相关性肾病的发生。
4.高脂可诱导小鼠肾脏过多脂肪沉积,可能不涉及SREBP-1c表达变化。