论文部分内容阅读
肝硬化是影响全世界人民健康的重大公共卫生问题,全球约8.44亿人患有慢性肝病,导致每年约有200万人死亡。而肝纤维化是终末期肝病的常见病理过程,可进展为肝硬化、肝功能衰竭、肝细胞癌等。因此我们应尽可能在疾病发生发展的早期就进行干预。近年来在一些动物模型上发现肝纤维化早期在去除致病因素后可以逆转,这就为我们的研究提供了新的方向,具有很大的研究意义和临床价值。肝纤维化的起始和进展过程都伴有炎性细胞的募集及炎性因子的分泌,因此肝纤维化的发展与肝脏的炎症微环境密切相关。未成熟树突状细胞（Immature dendritic cells,imDC）在体内除了能够诱导免疫耐受,还具有强大的抗炎作用,相关研究证明其可以通过抗炎作用改善肝纤维化过程中的炎性微环境,从而发挥抑制肝纤维化的作用。本篇论文通过体外实验研究人外周血来源的未成熟树突状细胞对于活化的人肝星状细胞系LX-2增殖和凋亡的作用以及相关机制。[目的]研究人外周血来源的imDC对激活的人肝星状细胞系LX-2增殖、凋亡的影响以及相关分子机制。[方法]1.imDC的诱导及鉴定:抽取健康志愿者外周血,使用Nycodenz-NaCl分离液,通过密度梯度渗透压离心从外周血中分离出CD14+单个核细胞。通过流式细胞仪检测CD14+单核细胞纯度。加入rhGM-CSF和rhIL-4诱导7天,使用流式细胞仪检测FITC-CD195（CCR5）鉴定细胞表型,FITC-dextran测定细胞抗原吞噬能力。2.LX-2 的激活:使用5ng/mL的TGF-β刺激LX-2,48h后RT-Qpcr 检测 α-SMA mRNA表达,获得活化的LX-2。3.实验分组:1.LX-2空白对照组;2.TGF-β诱导的激活LX-2组;3.TGF-β诱导的激活LX-2和imDC共培养组;4.TGF-β诱导的激活LX-2+IL-10（10ng/mL）组;5.TGF-β诱导的激活LX-2和imDC+IL-10（10 μ g/mL）拮抗剂共培养组。4.imDC对激活的LX-2抑制作用的研究:我们建立了上下双细胞共培养体系。LX-2与imDC以1:2的比例共培养,使用Transwell小室（孔径0.4μm）将两者区分。imDC细胞接种于上室,LX-2接种于下室。共培养48h后使用流式细胞仪检测LX-2的凋亡率,CCK-8检测LX-2的增殖情况,RT-Qpcr检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA 表达水平,Western blot 检测 LX-2 细胞的 TGF-β,Smad3,Smad7蛋白的表达。[结果]1.从外周血中分离出CD14单个核细胞,流式鉴定纯度为86.61±1.82%,然后使用rhGM-CSF和rhIL-4诱导7天可获得imDC,并使用流式细胞仪鉴定表面标记CD195为95.852±1.412%和抗原吞噬能力为92.74±4.93%,满足接下来共培养实验要求。2.5ng/mL 的 TGF-β 刺激 LX-2,48h 后 RT-qpcr 检测 α-SMA 的 mRNA 表达明显上调（P＜0.05）,此时LX-2被成功激活。3.流式细胞术检测LX-2凋亡结果提示,imDC和IL-10能够促进活化的LX-2凋亡,IL-10拮抗剂组拮抗了部分imDC的促凋亡作用（凋亡率:LX-2组8.29±0.59%;TGF-β+LX-2 组 9.74±0.50%;TGF-β+LX-2+imDC 共培养组24.33 ± 0.39%;TGF-β+LX-2+IL-10（10ng/mL）组 19.05 ± 0.19%;TGF-β+LX-2+imDC+IL-10 拮抗剂（10 μ g/mL）组 17.03±0.98%）。4.CCK-8结果提示与LX-2激活组相比,imDC组和IL-10组均能抑制LX-2的增殖（imDC组:P=0.0026;IL-10组P=0.0035）,IL-10拮抗剂组的增殖率要高于imDC组且有统计学意义（P＜0.001）。5.RT-qPCR检测发现imDC和IL-10均能下调TGF-β活化的LX-2中α-SMA的表达（imDC 组:P＜0.0001;IL-10 组 P＜0.0001）,imDC+IL-10 拮抗剂组的 α-SMA表达也有所下降,但是效应小于imDC组且差异具有统计学意义（P＜0.0001）。6.WB实验检测imDC对于TGF-β激活的LX-2促进凋亡,抑制增殖的相关机制是通过下调TGF-β 1,Smad3蛋白（P＜0.0001）,上调Smad7蛋白（P＜0.0001）。[结论]1.imDC通过分泌IL-10对TGF-β激活的LX-2起到促进凋亡,抑制增殖的作用。2.imDC通过分泌IL-10下调TGF-β激活的LX-2中α-SMA mRNA的表达,抑制LX-2的活化。3.imDC通过分泌IL-10下调TGF-β激活的LX-2中TGF-β1、Smad3蛋白的表达,上调Smad7蛋白的表达,可知imDC可能是通过TG-β1/Smad3通路促进LX-2凋亡,抑制增殖。