第一部分内毒素在大鼠肝肺综合症的作用前言肝肺综合征（hepatopulmonmy syndrome,HPS）是在慢性肝病和（或）门静脉高压基础上出现肺血管扩张、动脉血氧合功能异常,以慢性肝病、肺泡动脉血氧分压差[P（A-a）O₂]上升或动脉血氧分压（PaO₂）降低和肺内血管扩张为该综合征的临床三联症。肺血管扩张的发生机理现仍不清楚,可能与肝功能不全或门体侧支循环广泛建立后扩血管介质如前列环素、一氧化氮、血管活性肠肽等,未经肝脏代谢或灭活而直接进入体循环,机体扩血管介质如一氧化氮（NO）等增多,诱致肺血管扩张,通气-血流比例失调而致低氧血症。肝移植术后肝脏代谢的恢复,可完全纠正HPS患者的扩血管介质的异常代谢,但其低氧血症并没有得到完全改善说明HPS患者低氧血症并不是完全因为扩血管介质增多而致肺血管扩张所致。肝硬化患者内毒素血症发生率高,可有高浓度的内毒素血症,而无临床感染的症状,因为肝硬化时肝脏Kupffer细胞吞噬细菌能力减低,对门静脉血的细菌或内毒素清除能力下降,同时来自肠道的内毒素与G^-菌经门体分流进入体循环,绕过肝脏Kupffer细胞。肝硬化动物实验研究发现,肠道细胞移位发生率达高。在没有菌血症情况下已有内毒素血症存在。在内毒素诱导肺急性损伤时可导致肺泡毛细血管的通透性增加,促进中性粒细胞、巨噬细胞在肺内聚集。推测肝硬化内毒素血症作用于巨噬细胞和直接导致肺炎症反应,而引起肺病理改变。目的建立大鼠肝肺综合症模型,研究内毒素在HPS肺损伤中作用。材料与方法结扎SD大鼠胆总管,建立肝肺综合征（HPS）动物模型。将大鼠分成二组（每组10只）:假手术组仅仅分离胆总管后关腹,HPS模型组结扎离断胆总管,6周后检测血清内毒素,进行血、腹水、胆汁细菌培养,血气分析,测定门静脉压力,肺干重/湿重比,血、肺灌洗液和肺组织匀浆的髓过氧化物酶（MPO）含量及丙二醛（MDA）浓度,并评价肺组织病理变化。结果HPS大鼠肝硬化,肺部炎症明显,聚集大量巨噬细胞。与假手术对照比HPS模型组内毒素浓度显著增高,门静脉压力、肺组织肺干重/湿重比,血、肺灌洗液及肺匀浆中的MDA和MPO含量均有显著增高。讨论HPS模型组大鼠从肝、肺病理学改变到门脉压增高、脾增大、酸碱平衡紊乱、肺干湿比增高,说明模型制作成功。结果显示:与较假手术对照组相比,HPS模型组感染增高;血浆内毒素上升幅度达10倍以上。可能由于肝硬化时黏膜屏障功能降低,肝细胞和Kupffer细胞功能严重障碍,吞噬细菌能力减低,对门脉血的细菌或内毒素清除能力下降;同时门-体分流的形成致使肠道细菌易位及内毒素入血,形成菌血症和肠源性内毒素血症。肺病理发现肺部有大量巨噬细胞聚集,正常大鼠肺内没有巨噬细胞,内毒素诱导肺损伤时可导致肺泡毛细血管的通透性增加,促进中性粒细胞、巨噬细胞在肺内聚集,导致大量炎症因子和氧自由基释放,造成肺血管内皮和实质细胞损伤。MDA与MPO增高对HPS肺有损伤作用,在肺病理观察到肺纤维增生而证实。结论内毒素在肝肺综合征的肺损伤中作用第二部分左氧氟沙星在肝肺综合症的作用与机制研究前言第一部分试验说明HPS的发病过程中与细菌异位和内毒素有关。在内毒素诱导肺损伤时可导致中性粒细胞、巨噬细胞在肺内聚集,肝硬化内毒素血症作用于巨噬细胞或直接导致肺炎症反应,导致细胞因子如IL-1、ICAM-1、TGF-β、TNF-α、PDGF等的释放,引发肺间质纤维组织增生而致呼吸膜弥散障碍。内毒素主要来源于肠道细菌过度繁殖,用Norfloxacin减少肝硬化大鼠细菌移位,可缓解HPS病情,我们用新一代氟喹诺酮类抗菌剂左旋氧氟沙星米抑制细菌繁殖而降低内毒素,研究对肝肺综合症的肺部影响及其机制进行探讨。目的探讨左氧氟沙星抑制细菌繁殖,降低内毒素对大鼠肝肺综合征的肺损伤保护作用及其机制。材料与方法结扎SD大鼠胆总管,建立肝肺综合征（HPS）动物模型。将大鼠分成三组（每组10只）:假手术组分离胆总管,腹腔注射生理盐水1.2ml;HPS模型组结扎大鼠胆总管,腹腔注射生理盐水1.2ml;左旋氧氟沙星组结扎大鼠胆总管腹腔注射左旋氧氟沙星（20mg/kg体重）。6周后检测血清内毒素,血、腹水、胆汁培养需氧或厌氧菌,血气分析,测定门静脉压力,肺干重/湿重比,检测血、肺灌洗液和肺组织匀浆的TNF-α、TGF-β、IL-1β、PDGF-BB、一氧化氮（NO）、内皮素受体-1（ET-1）髓过氧化物酶（MPO）含量、丙二醛（MDA）浓度,原位杂交检测ICAM-1、TGF-β、IL-1βmRNA水平,免疫组化检测ED-1,PDGF-BB、TGF-β,RT-PCR检测肺TNF-α,PDGF-BB、ET-1、ICAM-1mRNA表达,Western blot测定肺ET-1、PDGF-BB、TGF-β蛋白表达,并Masson染色评价肺组织病理变化,电境观察肺Ⅱ型细胞改变。另外每组分别取50只大鼠作内毒素敏感性分析:手术后六周从大鼠尾静脉内注射LPS浓度分别为0.01、0.1、1、10、40mg/kg体重,观察三天以大鼠仰面放置不能翻身视为死亡。结果与HPS模型组比,左旋氧氟沙星组血浆内毒素浓度显著下降（p＜0.1）。对照组大鼠对内毒素耐受在10mg/kg体重才有死亡,最高在40mg全部死亡,而HPS组大鼠在0.1mg/kg体重就有7/10死亡,在10mg/kg全部死亡。左旋氧氟沙星组在0.01mg/kg体重紧紧死亡1只,在10mg/kg体重亦全部死亡。门静脉压力、肺干重/湿重比降低（p＜0.1）,血、肺灌洗液、肺组织匀浆中MDA、MPO、TNF-a、TGF-β、IL-1β、PDGF-BB、NO、ET-1含量在左氧氟沙星组与HPS组比较均有显著降低,原位杂交TNF-a、TGF-β、IL-1βmRNA表达水平在左氧氟沙星组与HPS组比较显著降低,免疫组化检测ED-1、PDGF-BB、TGF-β蛋白表达在左氧氟沙星组与HPS组比较显著降低,肺部TNF-a、PDGF-BB、ET-1mRNA在左氧氟沙星组与HPS组比较显著降低,ET-1、PDGF-BB、TGF-β蛋白表达在左氧氟沙星组与HPS组比较降低,所有上述指标在HPS组均显著高于假手术对照组。对照组对内毒素耐受良好,在10mg/kg体重才有死亡,最高在40mg全部死亡,而HPS组大鼠在0.1mg/kg体重就有7/10死亡,在10mg/kg全部死亡。左旋氧氟沙星组在1mg/kg体重紧紧死亡1只,在10mg/kg体重亦全部死亡,左氧氟沙星组肺炎症改变明显减轻,胶原减少,肺Ⅱ型细胞损伤减轻。讨论HPS发生后,细菌培养提示细菌移位明显增高,出现内毒素血症,血清内毒素含量显著增加10倍,而大鼠对内毒素耐受死亡率显著增高,假手术对照对内毒素耐受10mg/kg体重,而HPS大鼠为0.01mg/kg体重,耐受量竟然相差1000倍,说明HPS大鼠对内毒素耐受已经很低。肺内聚集大量ED-1阳性活化的巨噬细胞,不管血管内还是间质,都会释放氧自由基对肺部产生细胞毒作用,引起脂质、蛋白质和核酸的破坏,毁损细胞膜结构。给予左氧氟沙星处理后大鼠内毒素水平显著下降（p＜0.01）,细菌移位减少,ED-1阳性细胞减少,对内毒素耐受增强,血气分析改善,说明内毒素与HPS发生有密切关系。研究发现肝硬化患者呼出气中的NO含量增高。肝硬变时iNOs激活的可能是因为内毒素作用于肝脏,诱导肝脏的枯否细胞IL-1和TNF-a,IL-1和TNF-a再作用于肝细胞激活其内的诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）,iNOS催化精氨酸产生NO,只要内毒素存在此过程就反复进行,而使血浆内NO增加。HPS肺组织内eNOS增多,导致肺内NO增加。eNOS活性增强所致低氧血症、过度通气、P[（A—a）O₂]增加。NO与O₂反应生成超氧化的亚硝基阴离子,释放氧自由基,使肺内氧化和修复失去平衡,损伤气道组织,加重炎症反应。NO的增加必然会刺激ET-1的增加,局部肺组织中的ET—1水平应该能更直接地反映出ET-1与HPS发生机制之间的关系。而肺部主要通过表达ET—1受体B增加而使ET-1增加,与eNOs互相作用。而ET-1除具有收缩血管活性作用外,还是促进细胞有丝分裂的细胞因子,能促使血管平滑肌细胞和肺成纤维细胞增殖,使胶原分泌合成增加,而胶原蛋白的合成增加也是肺纤维化的主要环节。肺Masson染色发现HPS大鼠肺内有大量纤维组织堆集,电子显微镜发现肺Ⅱ型细胞板层小体空泡化、破裂,肺干湿比增大,说明肺有纤维化。PDGF-BB、TGF-β、TNF-a、IL-1β、NO、ET-1在肺部表达增强以及肺部大量聚集活化的巨噬细胞,引起肺的氧化与修复系统失去平衡,血管舒张收缩调解功能失调,二型细胞破坏,呼吸膜受损,呼吸功能失调,纤维增多发生纤维化。用左氧氟沙星来降低细菌繁殖移位后,内毒素下降,血清指标降低,肺部炎症细胞与炎症因子表达减少,Ⅱ型细胞病变减轻,纤维化程度下降,从而使血气分析得到改善,左氧氟沙星降低内毒素对HPS大鼠肺部具有保护作用。结论1左氧氟沙星通过降低通过降低内毒素而降低HPS肺损伤。2左氧氟沙星通过降低TNF-a,PDGF-BB、ET-1、TGF-β、ICAM-1保护肝肺综合征大鼠肺。第三部分茶多酚对HPS的影响前言降低内毒素后可以改善大鼠肺部病变,但是如果长期应用抗生素会带来二重感染等严重并发证。茶多酚是茶叶中最重要的功效成分,是30多种酚类化合物的复合体,约占茶叶干物质总量的18%～36%。现在对茶多酚的药理作用研究报道很多,尤其抗氧化、免疫调节有很好效果,而且其还有抗炎作用,研究表明茶多酚可抑制的厌氧菌和需氧菌,对葡萄球菌、大肠杆菌的有效率达98.30%,对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及厌氧菌等绝大多数致病菌均有作用。茶多酚可明显抑制巨噬细胞及其因子TNF-a、IL-1的活性和NO的生成,我们来探讨茶多酚对HPS发病的影响。材料与方法结扎SD大鼠胆总管,建立肝肺综合征（HPS）动物模型。将大鼠分成三组（每组10只）,动物模型制作试验第二部分。假手术对照组和HPS模型组术后每天给予生理盐水1ml灌胃,茶多酚组每天给予茶多酚250mg/kg体重灌胃,持续6周后取材,检测同试验第二部分。结果与HPS模型组比,茶多酚组血浆内毒素浓度显著下降。假手术对照组大鼠对内毒素耐受在10mg/kg体重才有死亡,最高在40mg全部死亡,而HPS组大鼠在0.1mg/kg体重就有9/10死亡,在10mg/kg全部死亡。茶多酚组在0.01mg/kg体重紧紧死亡1只,在10mg/kg体重亦全部死亡。门静脉压力、肺干重/湿重比降低,血、肺灌洗液、肺组织匀浆中MDA、MPO、TNF-a、TGF-β、IL-18、PDGF-BB、NO、ET-1含量在茶多酚组与HPS组比较均有显著降低,其中肺匀浆中NO、MDA、MPO和ET-1与假手术对照组比较无显著性差异。原位杂交TNF-a、TGF-β、IL-1βmRNA表达水平在茶多酚组与HPS组下相比显著降低,免疫组化检测ED-1、PDGF-BB、TGF-β蛋白在茶多酚组与HPS组比较显著降低,TNF-a、PDGF-BB、ET-1mRNA在茶多酚组与HPS组比较显著降低,肺ET-1、PDGF-BB、TGF-β蛋白表达在茶多酚组与HPS组比较降低,所有上述指标在HPS组均显著高于假手术对照组。茶多酚组肺组织炎症改变明显减轻,胶原减少,肺Ⅱ型细胞损伤减轻。讨论HPS大鼠体内细菌培养阳性率增高,移位明显,肠道细菌产生内毒素增多,内毒素敏感性死亡率增高。茶多酚具有抗菌作用抑制肠道细菌的过度繁殖,能够提高血清中IgG、IgM、IgA等的免疫球蛋白含量,增强机体抗感染能力,抵御细菌,而使茶多酚组内毒素显著降低。EGCG可使PDGFβ受体的活性抑制,可以降低PDGF-BB的作用。茶多酚可以降低TGF-β的基因表达与TNF-a、IL-1β水平,从而使血和肺局部浓度下降,减少其对肺损伤。内毒素血症引起肝kuffer细胞激活而产生大量氧自由基。肺巨噬细胞活化使成纤维细胞的脂质过氧化,从而促进肺部氧自由基增加。茶多酚具有两个以上的酚性羟基,能提供氢,具有抗氧化作用,而且其抗氧化活性,远高于维生素C和维生素E,是它们几倍到十几倍。茶多酚不但可以抑制脂氧化酶、环氧化酶、细胞色素P450酶系,髓过氧化酶活性。而且明显提高抗过氧化物酶如谷胱甘肽过氧化物酶、NADPH-氧化还原酶、谷胱甘肽-S-转移酶的解毒酶活性。茶多酚发挥抗氧化作用而清除NO的代谢毒物,多酚化合物降低iNOs水平,同时可通过抑制转移因子NF-κB结合到酶上抑制iNOs酶。EGCG可抑制酪氨酸的磷酸化过程,因而减弱了NF-κB的信号向核内传递,其对受体型的蛋白酪氨酸激酶的抑制活性比非受体型蛋白酪氨酸激酶—蛋白激酶C、蛋白激酶A、PP60v-src强,从而降低iNOs活性,进一步降低NO浓度。茶多酚中EGCG可以用过抑制p44/p42 MAP酶的激活与COX-1/2 mRNA表达而降低ET-1和ET-A受体表达而降低ET-1的水平,从而使血和肺中ET-1浓度减少,减轻肺部损伤。结论1茶多酚可以抑制细菌繁殖而降低HPS大鼠内毒素。2茶多酚可以清除HPS大鼠体内内氧自由基减轻肺的损伤。3茶多酚能够在降低TNF-a、IL-1β、TGF-β、PDG-BB、ET-1、NO水平而保护HPS大鼠肺。