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背景与目的食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carninoma,ESCC）是我国的高发肿瘤之一,目前患者的五年生存率仍低于20%。尽管在ESCC的诊疗方面已经取得了一定的进展,但是大家的关注点仍然主要放在负责编码蛋白质的一小部分DNA序列上,随着高通量测序技术的快速发展,大量长链非编码RNA（Long non-codingRNA,lncRNA）分子被鉴定,并发现其与肿瘤的进展存在密切关系,因此,从lncRNA的角度阐明肿瘤发生发展的机制有望成为攻克肿瘤进展的一个新的突破点。课题组前期收集了93对ESCC组织及其癌旁组织并对其进行了RNA测序（RNA sequencing,RNA-Seq）,DSCAM-AS1是在测序结果中筛选出的在ESCC组织中表达量显著升高的lncRNA。已经有研究表明,DSCAM-AS1是一种与癌症相关的lncRNA,其可以通过与RNA结合蛋白相互结合或者作为竞争性内源性RNA（competitive endogenousRNA,ceRNA）来调控肿瘤的进展,然而DSCAM-AS1在ESCC中的表达、功能和作用机制仍不清楚。近些年的研究表明lncRNA可以通过与微小RNA（microRNA,miRNA）结合来抑制miRNA对靶mRNA的调控作用。基于此,我们通过Starbase v3.0数据库在线预测到DSCAM-AS1可以与miR-376c-3p结合来抑制miR-376c-3p对SOX4 mRNA的调控作用。已经有文献报道,miR-376c-3p是一种与癌症相关的miRNA,miR-376c-3p在多种肿瘤中的表达均下调,然而尚无研究关注miR-376c-3p在ESCC中的表达与功能及其与DSCAM-AS1之间的关系。性别决定区Y框蛋白4（Sex-determining region Y-related high-mobility group box 4,SOX4）是与发育密切相关的转录因子,越来越多的证据表明SOX4可以调控包括ESCC在内的多种肿瘤的发生发展,令人感兴趣的是,近些年的研究发现SOX4可以作为多种miRNA的结合靶标在人类癌症中发挥作用,然而尚无研究报道SOX4和miR-376c-3p之间的关系。本研究将从以下三个方面探索DSCAM-AS1在ESCC中的生物学功能和分子机制。（1）明确DSCAM-AS1在ESCC中的表达和临床意义;（2）探讨DSCAMAS1对ESCC细胞增殖和侵袭迁移能力的调控作用;（3）阐明DSCAM-AS1通过与miR-376c-3p结合来抑制SOX4表达的分子机制。方法1 DSCAM-AS1在ESCC中的表达和临床意义通过RNA-Seq和定量逆转PCR（quantitative reverse transcription PCR,RTqPCR）检测DSCAM-AS1在ESCC组织和细胞中的表达水平,并分析其在ESCC组织中的表达与临床病理学参数和预后之间的相关性。2 DSCAM-AS1对ESCC细胞增殖和侵袭迁移能力的调控作用把ESCC细胞中的DSCAM-AS1敲低或者过表达后,采用CCK8、克隆形成和Transwell小室实验来检测DSCAM-AS1的表达变化对ESCC细胞的增殖和侵袭迁移能力的影响以及Western blot实验检测ESCC细胞中上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白的表达变化。3 DSCAM-AS1促进ESCC细胞增殖和侵袭迁移能力的分子机制3.1 DSCAM-AS1在ESCC细胞中的定位荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）和核质分离实验检测DSCAM-AS1在ESCC细胞中的具体定位。3.2 DSCAM-AS1与miR-376c-3p之间的相互结合Starbase v3.0数据库在线预测DSCAM-AS1与miR-376c-3p的结合情况并通过双荧光素酶报告实验验证其结合作用,通过RT-qPCR技术检测DSCAM-AS1的敲低或过表达对miR-376c-3p表达的影响来进一步证实其相关性。3.3 MiR-376c-3p在ESCC细胞中的表达通过RT-qPCR技术检测miR-376c-3p在ESCC细胞中的表达水平,并分析其与ESCC细胞中DSCAM-AS1表达的相关性。3.4 MiR-376c-3p对ESCC细胞增殖和侵袭迁移能力的调控作用及其对DSCAM-AS1介导的ESCC细胞表型的回复作用把ESCC细胞中miR-376c-3p敲低或者过表达后,采用CCK8、克隆形成和Transwell小室实验来检测miR-376c-3p的表达变化对ESCC细胞的增殖和侵袭迁移能力的影响。通过功能回复实验检测miR-376c-3p的抑制剂或模拟物对DSCAM-AS1的敲低或过表达介导的ESCC细胞表型的回复作用。3.5 MiR-376c-3p与SOX4 mRNA之间的相互结合Starbase v3.0数据库在线预测miR-376c-3p与SOX4 mRNA的结合情况并通过双荧光素酶报告实验验证其结合作用,通过RT-qPCR和Western blot技术检测miR-376c-3p的表达变化对SOX4表达的影响进一步证实其相关性。3.6 SOX4在ESCC中的表达通过RNA-Seq、RT-qPCR和Western blot技术检测SOX4在ESCC组织和细胞中的表达情况,并分析其与DSCAM-AS1和miR-376c-3p之间的相关性。3.7 DSCAM-AS1/miR-376c-3p/SOX4之间的表达相关性通过RT-qPCR和Western blot实验检测DSCAM-AS1的敲低或过表达对SOX4表达的影响以及miR-376c-3p对DSCAM-AS1介导的SOX4表达变化的回复作用来验证DSCAM-AS1/miR-376c-3p/SOX4三者之间的相关性。结果1 DSCAM-AS1在ESCC中的表达和临床意义相比于癌旁组织和正常食管上皮细胞Het-1A,DSCAM-AS1在ESCC组织和细胞中的表达均显著升高（P<0.05）;ESCC组织中DSCAM-AS1的高表达往往与病人的TNM分期、淋巴结转移和不良预后显著相关（P<0.05）。2 DSCAM-AS1对ESCC细胞增殖和侵袭迁移能力的调控作用生物学行为表明,DSCAM-AS1的下调可以抑制ESCC细胞的增殖和侵袭迁移能力（P<0.05）;DSCAM-AS1的上调可以促进ESCC细胞的增殖和侵袭迁移能力（P<0.05）。Western blot结果表明DSCAM-AS1的下调升高了E-cadherin蛋白的表达,但降低了N-cadherin和Vimentin蛋白的表达水平（P<0.05）;同时,ESCC细胞中DSCAM-AS1的上调降低了ESCC细胞中E-cadherin蛋白的表达,并升高了N-cadherin和Vimentin蛋白的表达（P<0.05）。3 DSCAM-AS1促进ESCC细胞增殖和侵袭迁移能力的分子机制3.1 DSCAM-AS1在ESCC细胞中的定位FISH和核质分离实验结果表明DSCAM-AS1主要分布在ESCC的细胞质中。3.2 DSCAM-AS1与miR-376c-3p之间的相互结合Starbase v3.0数据库的预测结果表明DSCAM-AS1可以与miR-376c-3p互补结合。双荧光素酶报告实验的结果证实了DSCAM-AS1与miR-376c-3p之间的互作。RT-qPCR实验结果表明,将DSCAM-AS1敲低后,miR-376c-3p在ESCC细胞中的表达水平升高（P<0.05）;而将DSCAM-AS1过表达后,miR-376c-3p在ESCC细胞中的表达水平降低（P<0.05）。3.3 MiR-376c-3p在ESCC细胞中的表达情况RT-qPCR结果显示,miR-376c-3p在ESCC细胞中的表达显著低于正常食管上皮细胞,与ESCC细胞系中DSCAM-AS1的表达成负相关（P<0.05）。3.4 MiR-376c-3p对ESCC细胞增殖和侵袭迁移能力的调控作用及其对DSCAM-AS1介导的ESCC细胞表型的回复作用生物学行为表明,miR-376c-3p的下调显著促进了ESCC细胞的增殖和侵袭迁移能力（P<0.05）;而miR-376c-3p的上调显著抑制了ESCC细胞的增殖和侵袭迁移能力（P<0.05）。令人感兴趣的是,miR-376c-3p的抑制剂或模拟物还可以不同程度地逆转DSCAM-AS1敲低或过表达介导的ESCC细胞增殖和侵袭迁移能力的变化（P<0.05）。3.5 MiR-376c-3p与SOX4 mRNA之间的相互结合Starbase v3.0数据库的预测结果表明miR-376c-3p可以与SOX4 mRNA互补结合。双荧光素酶报告实验的结果证实了miR-376c-3p与SOX4 mRNA之间的互作。RT-qPCR和Western blot实验结果表明,miR-376c-3p的敲低可以促进SOX4在ESCC细胞中的表达（P<0.05）;而miR-376c-3p的过表达可以抑制SOX4在ESCC细胞中的表达（P<0.05）。3.6 SOX4在ESCC的表达情况RNA-Seq数据表明SOX4 mRNA在ESCC组织中的表达显著高于癌旁组织,与ESCC组织中DSCAM-AS1的表达成正相关（P<0.05）。RT-qPCR结果表明,SOX4 mRNA在ESCC细胞中的表达显著高于正常食管上皮细胞,与ESCC细胞中miR-376c-3p的表达成负相关（P<0.05）。Western blot结果表明SOX4蛋白在ESCC细胞中的表达显著高于正常食管上皮细胞（P<0.05）。3.7 DSCAM-AS1/miR-376c-3p/SOX4 mRNA之间的表达相关性RT-qPCR和Western blot实验结果表明miR-376c-3p的抑制剂或模拟物可以不同程度地逆转DSCAM-AS1敲低或过表达介导的ESCC细胞中SOX4 mRNA和蛋白的表达变化（P<0.05）。结论1 DSCAM-AS1在ESCC的组织和细胞系中均高表达,其高表达与ESCC患者的TNM分期、淋巴结转移和不良预后相关。2 DSCAM-AS1通过与miR-376c-3p结合来上调SOX4的表达,从而促进ESCC细胞的增殖和侵袭迁移。