一氧化氮（Nitric oxide,NO）是一种主要大气污染物,极易造成臭氧层耗竭或酸雨酸雾等二次环境污染问题。生物净化法已被证明是绿色治理NO的有效方法,该方法去除NO的主要原理是微生物主导的反硝化反应,即微生物体内的关键还原酶可结合底物NO,通过酶促反应将NO还原为无毒无害的N₂。本文以课题组前期筛选获得的一株反硝化细菌Achromobacter denitrificans strain TB为实验菌株,通过细菌De Novo测序获得该菌株基因组序列,并对序列中的反硝化基因进行了鉴定。以测序获得的一氧化氮还原酶（Nitric oxide reductase,NOR）编码序列为参考,PCR扩增成功得到TB菌中的norB基因,并通过表达载体的构建获得了基因工程菌E.coli BL21（DE3）-pET28a-norB。通过IPTG的诱导,使NorB蛋白在大肠杆菌内得到表达,然后从mRNA水平检测了norB基因在菌株内的转录情况,并考察了该菌株对NO的还原性能,主要结论如下:通过细菌De Novo测序获得Achromobacter sp.TB全基因组序列,该序列总长6692590 bp,GC含量67.39%。其中反硝化基因有5类,narKKGHJIQL、napEDABC、nosRZDFYL基因成簇存在,nir、nor结构基因仅有nirK与norB;nos、nor、nir、nar按顺序排列在基因组反义链上,以相同方向转录,nap单独位于基因组正义链上,按与其他基因相反的方向转录。按照Achromobacter sp.TB全基因组中的NOR编码序列设计特异性引物,以Achromobacter sp.TB基因组DNA为模板,PCR扩增后构建TA克隆,测序得到长1218 bp的目的基因norB。生物信息学分析发现:norB编码405个氨基酸,预测NorB蛋白分子量大小44.7 kDa,含10个跨膜螺旋,为疏水性蛋白。系统发育树分析表明:Achromobacter sp.TB与Achromobacter denitrificans strain PR1中的norB序列同源的置信度为100。利用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切反应构建基因表达载体pET28a-norB,转化大肠杆菌获得基因工程菌E.coli BL21（DE3）-pET28a-norB。利用IPTG诱导NorB蛋白表达,最佳诱导条件为:在细菌对数期(OD₆₀₀为0.6左右)加入IPTG终浓度为1.0 mM,30℃下诱导5 h。mRNA转录水平实验结果显示:工程菌中norB基因的相对表达丰度达0.83%;NO降解效率检测结果发现:工程菌可将NO还原为N₂O,13 h内还原效率为7.16%,这些结果表明了norB基因在E.coli BL21（DE3）中被成功转录表达,同时表达的NorB蛋白具有NO还原活性。野生菌TB的NO还原效率（33.48%）约为工程菌的4.68倍,然而其中norB的相对表达丰度却仅有0.05%,这说明了工程菌中克隆的norB基因仅是TB菌NOR中催化NO还原的核心编码序列,还有一些与norB基因共同转录表达的辅助序列未被克隆,这些辅助序列承担着提高NOR酶活性的关键作用。Achromobacter sp.TB菌NOR中催化还原结构的核心肽段能够独立发挥NO还原功能。