受精是一个新个体产生的标志,是指精子和卵子自发融合成为受精卵的过程,要完成这一过程必须具备一定的条件,精子获能就是其中之一。获能是指精子获得使卵细胞受精的能力,是精子在自然状态下完成受精过程的一个必需条件。哺乳动物的精子在受精前都要经历获能过程。在精子获能过程中,对于精子质膜的修饰改变是这一过程的一个关键事件。但是迄今为止,对于这一重要事件分子机制的研究结果还不多,远不能阐明这一过程。Ezrin蛋白是ERM蛋白家族的成员之一,也是该家族中被研究最多的蛋白。在体细胞中的大量研究显示,ezrin是细胞皮质骨架蛋白与细胞质膜固有膜蛋白之间的衔接蛋白,它的主要作用是通过对骨架蛋白与膜蛋白的衔接作用,引起细胞膜表面结构的重构,从而介导包括细胞黏附、变形、微绒毛形成等一系列的细胞事件。不仅如此,活化的ezrin还能够和Rho解离抑制因子——RhoGDI一起促进细胞表层骨架蛋白的形成,从而使actin聚合形成F-actin。因此,在体细胞中就存在一个由ezrin、actin、RhoGDI、Rho蛋白以及质膜蛋白共同形成的蛋白网络体系。这个蛋白网络的主要作用就是对细胞膜的表面结构进行组装。本实验室在前期研究工作中发现,ezrin和RhoGDI1表达于人睾丸组织中,那么,会不会前述与ezrin相关的蛋白网络体系也能在精子中发挥功能呢?因为在精子获能过程中也存在膜重构的现象。我们推测,这个网络体系可能作用于精子获能过程中的膜重构。针对这一问题开展了以下研究:(1)用ERM家族磷酸化位点的抗体行不同获能状态精子蛋白的Western Blot实验,结果显示在精子获能过程中,ezrin第567位苏氨酸发生了磷酸化修饰,这说明ezrin在获能过程中被活化。推测活化后的ezrin可以与下游一系列蛋白通过直接或间接相互作用参与膜的重构,故运用一系列免疫共沉淀试验进行验证。(2)用免疫共沉淀方法比较获能前后ezrin与RhoGDI1相互作用情况,结果显示,两者的相互作用在获能后增加;运用二维电泳结合银染和磷酸化染色方法,结果显示,RhoGDI1自身还在获能过程中发生了磷酸化修饰,前述两个结果均可导致RhoGDI1自Rho蛋白解离下来。对后者用免疫共沉淀的方法进行验证,结果符合预想,RhoGDI1与RhoA的相互作用在获能后减弱。这一结果提示RhoA可参与下游一系列通路导致F-actin形成。(3)对于这一系列事件的最终结果用F-actin特异性染料Texas Red-Phalloidin染色进行分析,结果显示,获能后,精子的F-actin染色尤其是头部的染色明显增强。说明获能过程中actin聚合。(4)据体细胞中的研究,ezrin可以和F-actin相互作用,故运用Co-IP方法对ezrin和F-actin的相互作用进行分析,结果显示获能后ezrin与F-actin的相互作用增强。这与体细胞中的现象类似,因此我们推测ezrin还可通过其氨基端与膜相互作用。(5)筛选了一个精子膜蛋白cd44,同样运用免疫共沉淀的方法比较其与ezrin相互作用情况,结果显示,ezrin在获能后与cd44相互作用增加,且ezrin不仅可以和cd44的未修饰形式相互作用,还可与其糖基化修饰形式相互作用。(6)最后,分析ezrin和actin在获能中可能的功能,分别用ezrin和actin抗体对获能和顶体反应进行阻断,结果显示,ezrin和actin抗体能够阻断精子获能但对于顶体反应则没有影响。总之,本研究为人精子获能分子机制提出了一个新的假说,即在人精子获能过程中,ezrin、RhoGDI1、actin、RhoA及膜蛋白可以通过相互作用形成一个蛋白网络体系,这样的网络可以调节获能过程中精子质膜重组、精子膜蛋白的重新分布,从而促进精子与卵子的受精过程。