铜是生物体必需的微量元素之一，它作为许多蛋白和酶的活性组分参与体内的许多生化反应。然而游离态的铜通过参与氧还循环(Cu2+→Cu+)而产生对生物体有害的自由基型活性氧，失去调控的过量铜的存在会干扰细胞内一些重要的生命活动，为确保充足的铜以驱动基本的生化反应，同时也为了防止铜过量累计造成氧还损伤，原核和真核细胞自稳态调控体系通过专用的蛋白控制铜的吸收、分布和代谢。这些铜稳态机理是通过细胞内铜感应蛋白，铜分子伴侣等动力学调控的，而感应机理是由遗传基因所调控，与蛋白稳定性及铜在蛋白间转运有关。　　CopC是存在于假单胞菌内由同一质粒编码的四个抗铜蛋白(CopABCD)之一，它与位于外膜的CopB、内膜的CopD、以及与它同处于质膜空间的CopA，在CopR，CopS调控基因的直接参与下，通过在细胞周质和外膜簇集多余铜而实现格兰氏阴性菌的抗铜作用。Apo-CopC呈现一种由九股β带形成的希腊拓扑β-sandwich结构，83位唯一的色氨酸位于两β层间，在相距约30(A)的N端和C端分别具有Cu(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合位点，Cu(Ⅱ)由(His)2(Asp)/(Glu)(OH2)组成一个近似平面正方形的配位方式;而Cu(Ⅰ)由(His)(Met)3,4构成一个四面体的配位方式。这使它区别于存在细胞质间的只有Cu(Ⅰ)位点的铜伴侣。对CopC的研究，可以为揭示存在高氧化质膜空间的铜伴侣执行抗铜功能，提供有助的线索;而且可以从化学角度，为研究铜大量生物体系中保守的自稳态平衡提供一定的理论数据。　　本文首先利用PCR技术，在野生型CopC蛋白的基础上得到突变体W83L的重组质粒，并且将其转入大肠杆菌(E.coli) BL21中，经IPTG诱导获得了突变蛋白MCopC。并经阴、阳离子交换柱和分子筛层析等多步纯化得到了较高纯度的蛋白。产品经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、质谱、紫外—可见吸收光谱和荧光谱多种方法证实。CopC和MCopC的获得为CopC蛋白的性质以及生物功能模拟研究准备了必要的材料。　　通过荧光光谱和紫外—可见吸收光谱研究了83位色氨酸在CopC蛋白中的重要性。研究发现CopC位于318nm处的特征荧光峰源于83位色氨酸的发射，酪氨酸与色氨酸间存在能量转移，并据能量转移效率获得了两者间的距离。荧光动态淬灭实验也证明色氨酸处于蛋白疏水性结构域中。色氨酸突变使突变体MCopC结合Cu(Ⅱ)离子的能力下降，使蛋白的疏水性空腔更易为疏水探针TNS接近，使蛋白对热稳定性下降，这些都意味着83位色氨酸突变对CopC性质有重要的影响。　　利用CopC荧光强度变化、光谱参数A、“荧光相位图”、CopC结合Cu(Ⅱ)离子随胍浓度的变化等方法，研究了apo-CopC和CopC-Cu(Ⅱ)在盐酸胍溶液中的解折叠行为。结果表明，apo-CopC和CopC-Cu(Ⅱ)两蛋白在盐酸胍溶液中都遵循可逆的“两态”模型，根据“两态”模型得到两者的稳定化能，分别为17.08±0.35 kJ·mol-1和23.81±0.45 kJ·mol-1。结合Cu(Ⅱ)辅因子增大了CopC在水溶液中的稳定化能。动力学实验证实，结合Cu(Ⅱ)后蛋白减缓了解折叠速率，提高了重折叠速率，从而使蛋白稳定性得以提高。　　TNS是常用于探测生物大分子疏水域的荧光探针。在本实验中发现较低浓度的TNS可以使CopC的构象发生改变。构象变化使蛋白荧光强度降低、峰位红移、Cu(Ⅱ)结合能力和CopC荧光偏振P下降。随着疏水基团的增加，萘胺类化合物α-萘胺、N-苯基萘、TNS对CopC构象干扰程度逐渐增强。萘胺类化合物对CopC构象的干扰主要基于疏水作用，静电作用对其起增强作用。　　CopC除了通过簇集铜而实现铜抵抗作用外，还可能通过与其它Cop蛋白间的铜转运而实现铜的摄入或多余铜的排出。在CopC所处的高氧化质膜空间，铜离子主要以Cu(Ⅱ)形式存在。在模拟CopC将Cu(Ⅱ)传递给其它Cop蛋白的过程中，设计了两种反应体系:一是CopC-Cu(Ⅱ)+EDTA(CDTA)，用EDTA(CDTA)来模拟质膜中可能出现的小分子Cu(Ⅱ)配体;二是CopC-Cu(Ⅱ)+MCopC，用MCopC来模拟CopC传递Cu(Ⅱ)的目标蛋白。根据表观速率常数对EDTA(CDTA)浓度的线性依赖关系，CopC-Cu(Ⅱ)与EDTA、CDTA的反应归结为配体间直接交换Cu(Ⅱ)的一步反应;根据表观速率常数与M MCopC浓度间的关系式kobsd=k2K[MCopC]/(1+K[MCopC])，蛋白间的Cu(Ⅱ)转运则推测为两步反应:首先是生成CopC-Cu(Ⅱ)-MCopC中间体的快速平衡反应（式1），接着由中间体解离为目标产物（式2），该步骤为速控步。CopC-Cu(Ⅱ)+MCopCk1→←k-1CopC-Cu(Ⅱ)-MCopC(1)CopC-Cu(Ⅱ)-MCopC→k2MCopC-Cu(Ⅱ)+CopC(2)两类转运机理是不同的。此外获得了CopC-Cu(Ⅱ)与MCopC反应的热力学参数以及活化能。　　CopC具有两类结合位点，分别对Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)具有高亲性结合能力，二者相距约30 A，这使它区别于一些只具有Cu(Ⅰ)位点的铜伴侣。在抗坏血酸还原CopC-Cu(Ⅱ)的过程中发现:未占据Cu(Ⅰ)位点时，抗坏血酸较容易还原CopC-Cu(Ⅱ);当Cu(Ⅰ)位点被部分占据时，还原速率减慢;当Cu(Ⅰ)位点完全被占据时，Cu(Ⅱ)基本不能被还原。推断Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)两位点存在相互依赖性，二者的相互协同作用有利于铜离子从Cu(Ⅱ)到Cu(Ⅰ)价态间转化。该性质与CopC作为一个铜转运载体相一致，这使它易于与CopA、CopB和CopD交换Cu(Ⅰ)或Cu(Ⅱ)。　　除铜离子外，CopC还可以结合Hg(Ⅱ)和Ag(Ⅰ)。本文从Au(Ⅲ)对CopC荧光淬灭方式、Au(Ⅲ)在缓冲与CopC溶液中的电势变化、Au(Ⅲ)对CopC的紫外差光谱以及CopC对Au(Ⅲ)催化抗还血酸氧化的影响等多个角度，证实了CopC蛋白中存在Au(Ⅲ)结合位点，并且每摩尔蛋白可与两摩尔Au(Ⅲ)结合。