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研究目的:1、对脂肪间充质干细胞(A-MSCs)进行三维培养,并对其进行形态学和表面分子学鉴定,来检测其免疫调控功能。2、建立急性移植物抗宿主病(GVHD)的小鼠模型,并通过二维(2D)与三维(3D)培养的A-MSCs对其进行治疗,比较两种方式培养后的细胞对急性GVHD小鼠肝组织损伤的治疗效果差异,并进一步探究其作用机制。研究方法:1、提取原代A-MSCs,对其进行表型鉴定和三系分化能力检测。2、采用可溶性微载体的方式构建A-MSCs的3D培养体系,并与2D的A-MSCs比较细胞的迁移能力。3、使用CFSE来检测2D和3D模式培养对A-MSCs增殖活性的影响。4、检测2D和3D培养后的A-MSCs的凋亡比例。5、通过PCR和Western blot来检测2D和3D培养后,A-MSCs免疫调节相关蛋白表达水平。6、T淋巴细胞分别与2D和3D培养的A-MSCs共培养,检测其中CD3+CD8+T细胞的增殖程度、凋亡比例和上清中IFN-γ的水平。7、采用辐照和脾脏淋巴细胞移植来构建小鼠GVHD模型,通过2D和3D培养后的A-MSCs对GVHD模型进行治疗并监测体重、生存情况、活动度、毛发、弓背和腹泻的情况,Elisa检测血清中IFN-γ和TNF-α的水平,流式细胞技术分析外周血Th1细胞的比例,同时取靶器官肝脏进行HE染色检测肝脏损伤的程度。8、通过Western Blot检测A-MSCs治疗后GVHD小鼠肝脏中JAK2、STAT1、p-JAK2、p-STAT1、T-bet 的表达。研究结果:1、提取的原代A-MSCs表达MSC的表面标记,并能够成软骨、成骨和成脂。2、3D培养的A-MSCs具有更高的细胞活性和迁移能力,增殖能力与2D组无明显差别,而凋亡比例略有增加,TLR3、TLR4和IDO1表达升高。3、与2D组相比,T淋巴细胞与3D培养的A-MSCs共培养后,CD3+CD8+T细胞增殖能力下降,凋亡比例增加,上清中IFN-γ水平降低。4、与2D组相比,3D培养的A-MSCs治疗后的GVHD小鼠体重的提高速度快,生存质量提高,活动度更高,拱背程度和腹泻症状更轻,HE染色显示肝脏损伤程度明显减轻。5、与2D组相比,3D培养的A-MSCs治疗后,GVHD小鼠血清中炎症相关因子IFN-γ和TNF-α的分泌均减少,Th1细胞比例明显下降。6、与2D组相比,3D培养的A-MSCs治疗后的GVHD小鼠肝脏中JAK2、STAT1、p-JAK2、p-STAT1和T-bet的表达水平均下降。结论:1、3D培养的A-MSCs具有多向分化能力,与2D模式相比,凋亡比例轻度增加,迁移能力提高,增殖能力无显著差异,组织归巢能力明显提高;2、3D培养后的A-MSCs,TLR3、TLR4和IDO1表达上调,具有更强的免疫调控功能;3、3D培养的A-MSCs所具有的更强的免疫调控功能,可以更大程度得降低GVHD小鼠血清中Th1细胞所分泌的IFN-γ水平,抑制GVHD肝脏中JAK2/STAT1通路的表达来减少肝组织炎症反应与纤维增生,此外还显著下调T-bet转录因子,进一步抑制外周血中Th0细胞向Th1细胞的转化,降低全身炎症反应,保护肝脏组织,减轻GVHD中肝脏损伤。