论文部分内容阅读
狼蛛在世界各地分布广泛,隶属节肢动物门、螯肢亚门、蛛形纲、蜘蛛目,在蜘蛛目中按物种多样性来划分位居第四,其毒液中含有丰富的多肽毒素待开展研究。近年来凝血酶Thrombin是开发促凝与抗凝血药物的重要靶点,ASIC3通道是治疗细胞外酸化所致疼痛的重要靶点,Thrombin和ASIC3的调制剂筛选仍是当前研究的热点与方向。在前期研究中,已从格氏狼蛛毒液中鉴定出一种新的具有促凝血因子活性及酸敏感离子通道抑制剂多肽毒素LCTX-F2。在凝血因子方面,可以促进凝血因子FXa、FXIIa、Thrombin和Kallikrein的酶活力,加快血液的凝固。另外在酸敏感通道方面,LCTX-F2可逆性抑制ASIC1a和ASIC3通道电流,其IC50分别为5.8μM和4.6μM。但LCTX-F2促进凝血因子活性和抑制酸通道活性的关键位点尚不清楚。多肽毒素LCTX-F2包含65个氨基酸残基,由4对二硫键组成,其相对分子质量为7452 Da,是一个经典的抑制剂半胱氨酸结（ICK）结构模体。NCBI-BLAST序列比对中,LCTX-F2与穴居狼蛛（Lycosa singoriensis）转录组中的多个氨基酸序列具有高同源性,但这些同源多肽的功能未知,因此LCTX-F2将对后续的同源多肽研究具有参考价值。本研究根据多肽的性质,在LCTX-F2原核表达载体上利用定点突变技术成功构建了16个突变体（K2E、R7E、R15E、R20E、D10A、D10R、D14A、D14R、D26A、D26R、F31A、V41A、G35A、S43A、E54A和K61A）。并通过原核表达技术和反相液相色谱分离纯化获得纯品目的多肽,进一步研究LCTX-F2突变体对Thrombin和ASIC3活性的变化。LCTX-F2突变体在Thrombin的促酶力活性检测中显示,当2、7和15号位的正电荷氨基酸突变成负电荷氨基酸后（K2E、R7E、R15E）,活性分别下降42.4%,64.5%,44.6%,尤其是第7号位的精氨酸被替换成谷氨酸显著性降低LCTX-F2的活性,10号位的负电荷氨基酸突变成正电荷氨基酸后（D10R）,活性下降24.5%,而其它部位氨基酸突变对LCTX-F2与Thrombin的结合贡献微弱。由于设计的16个突变体中2个C端突变体对LCTX-F2的活性也无明显改变,故推测在促凝血酶的活性影响中,是由LCTX-F2的N端的2、7、10和15位氨基酸起到一个关键作用。另一方面,LCTX-F2突变体在rASIC3通道的抑制活性检测中显示,7号位精氨酸及10号位天冬氨酸的突变（R7E、D10A、D10R）抑制活性显著性减弱,当50μM的R7E、D10A和D10R刺激下,对rASIC3通道分别才起到27.3%、18.1%和8.3%抑制效果,而2号位赖氨酸突变成谷氨酸（K2E）,针对于rASIC3抑制活性和选择性相比LCTX-F2显著增强,IC50提高至0.35μM,对于其它部位的氨基酸突变与LCTX-F2抑制活性活性相比无明显差异,说明K2、R7和D10是与rASIC3通道结合的关键活性残基。综上所述,本研究在多肽毒素LCTX-F2促进凝血因子活性和抑制酸通道活性的关键位点探究中,发现LCTX-F2的N端是关键活性部位显著改变多肽的亲和力,其中K2、R7和D10是关键活性残基,为后续分析LCTX-F2与凝血因子和ASIC3通道的结构功能关系提供了研究基础。同时,改造出的突变体K2E是一个具有更高活性和高选择性的ASIC3通道抑制剂,可作为一个全新的工具分子助于ASIC3结构与功能的研究和药物先导分子用于细胞外酸化引发的疾病治疗。