论文部分内容阅读
目的:建立一种未知病毒性病原体的检测方法-序列非依赖的单引物扩增（sequence independent single primer amplification,SISPA）技术,为传染病疫情尤其是新发传染病的预防控制、临床诊断及治疗提供科学依据。方法:1以发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（Severe Fever with Thrombocytopenic Syndrome Bunyavirus,SFTSV）毒株为研究对象,对样品进行过滤及DNase I消化处理,并对处理后的SFTSV毒株提取总RNA。2使用含有已知片段的随机引物对提取的RNA进行逆转录,合成双链cDNA,并对其进行纯化。3将随机引物中的已知片段作为单引物,非特异性扩增（SISPA-PCR）病原体基因。4对SISPA-PCR扩增产物进行分析及纯化回收、TA克隆。5鉴定克隆结果,选出含有插入片段的重组质粒进行测序,应用BLAST软件比对分析该核酸的同源性,判断其所属物种。6将SFTSV毒株提取的核酸进行10倍连续梯度稀释,并以稀释样品为研究对象,对建立的SISPA方法进行灵敏度分析。7以本实验室提供的肠道病毒毒株CoxA16和EV71、甲型流感病毒毒株H1N1及该几种病毒的混合液为研究对象,对建立的SISPA方法进行特异度分析。8 SISPA方法的应用,应用SISPA方法检测河北省平山县采集的76份临床诊断为病毒性脑炎的脑脊液标本。结果:1 SISPA方法的初步建立:SISPA扩增SFTSV毒株中的RNA,可以得到多个DNA片段,然后将所有PCR产物回收纯化、克隆、测序,经BLAST软件分析,与Gen Bank中的SFTSV基因序列同源性最高达98%,可判断所检测的病原体为SFTSV;2灵敏度分析:稀释后的SFTSV核酸浓度区间为106-101TCID50/ml。稀释样品经SISPA-PCR扩增,电泳显示浓度为106-102TCID50/ml的样品呈现出典型的SISPA扩增条带,且在不同时间进行的至少3次实验结果一致,由此可见,该方法对病毒SFTSV的检测下限可达到102 TCID50/ml,灵敏度较高,可检测低浓度的病毒核酸;3特异度分析:将CoxA16、EV71及HIN1毒株及该几种病毒的混合液分别经SISPA-PCR扩增,分别获得多个DNA片段,经TA克隆、测序及序列分析,与GeneBank中的CoxA16、EV71及H1N1基因序列同源性分别高达98%、97%、99%,可判断检测的病原体分别为CoxA16、EV71及H1N1,且在不同时间进行的至少3次实验结果一致,由此说明该方法可在一个反应体系中特异地将多种病毒检测出来,特异度较好;4 SISPA方法的应用:SISPA-PCR方法检测河北省平山县采集的76份临床诊断为病毒性脑炎的脑脊液标本,其中有11份检测为Echo18阳性。结论:1成功建立了应用序列非依赖的单引物扩增（SISPA）技术检测未知RNA病毒性病原体的技术平台。2建立的SISPA方法不依赖病毒分离培养,缩短了检测未知病毒的时间,可快捷地鉴定病毒性病原体。3建立的SISPA方法的检测下限是102TCID50/ml,可用于检测低浓度的未知序列的病毒核酸。4 SISPA方法既适用于检测已知病毒,也适用于检测未知病毒,适用范围较广。