精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)具有自我复制和分化的潜能，是成年动物体内能进行遗传信息传递的唯一类型的干细胞，也是维持精子发生这一有序调控过程的起始细胞。精原干细胞在体外的增殖与诱导分化为研究和阐明精子发生机理提供了新的方法和途径；利用体外培养的SSCs，结合移植技术，还可在体外对SSCs的基因组进行操作，从而进行某些遗传性疾病的基因治疗，或者制作转基因动物；重要的是，SSCs的体外培养与其它生物学技术综合运用，可以使我们能够保护濒危动物物种以及治疗人类因化疗和放疗引起的内源性SSCs损伤和恢复男性生育能力。 然而，精原干细胞在体外的存活和增殖受到许多因素的影响，如培养基和添加剂的选择，血清的浓度，生长因子、激素和维生素的使用等，且不同的动物种类和品系需要不同的培养体系。以前的研究表明，血清和睾丸体细胞导致SSCs分化。因此，在体外培养时，使用高度富集的SSCs和无血清培养体系是至关重要的。许多研究已经证明，GDNF及其通路是维持SSC自我增殖的主要因子和通路。 在本研究中，我们从小鼠睾丸组织提取总RNA，以已知的小鼠GDNF基因cDNA序列没计引物，利用RT-PCR克隆目的基因，并构建了pcDNA3.1-GDNF表达质粒载体。采用脂质体法将表达质粒转染体外培养的NIH-3T3细胞，通过G418筛选出阳性细胞克隆，并用RT-RCR、免疫细胞化学和westem-blot等手段对这些克隆的后代细胞进行了鉴定。结果表明，我们获得了稳定表达外源性GDNF的NIH-3T3细胞株。根据以前的报道：不同的饲养细胞层对SSCs的自我增殖有不同的影响，并且NIH-3T3细胞更支持SSCs在体外的增殖。因此，我们以转GDNF基因的NIH-3T3细胞作为饲养层，并用我们的无血清培养基培养小鼠精原干细胞。 用于培养的小鼠精原干细胞来自ICR乳鼠，是通过反复贴壁的方法获得的。培养结果表明，富集的SSCs在这一培养体系中能够存活，产生了SSCs克隆，并以较缓慢的速率增殖，在体外培养维持时间在15天左右，此后的细胞出现凋亡特征。这一结果说明，尽管GDNF是促进SSC自我复制的关键因子，并在这一体系中添加了GDNF和使用了表达外源GDNF的3T3饲养层，但并不能维持小鼠SSCs在体外的长期增殖，暗示该体系中可能含有某些不利因子。KSR是胚胎干细胞的常用无血清培养基，还没有报道表明它对SSCs的作用，在本研究中，我们首次报道了它对小鼠SSCs的影响。与以前报道的使用其它培养基进行的SSCs的体外培养结果相比，我们所使用的无血清培养基KSR显著改善和提高了SSCs在体外的存活和增殖活性。因此，我们认为KSR无血清培养基可以经过进一步改良后用于小鼠SSCs的体外培养。