中国青岛文昌鱼C型凝集素AmphiCTL的发现及其相关性质研究

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文昌鱼是一个介于脊椎动物与无脊椎动物的过渡物种,其天然免疫系统相对完善。参与模式识别反应的模式识别受体在文昌鱼的天然免疫系统中发挥着重要的作用。本文通过一系列研究手段,对中国青岛文昌鱼的一个第Ⅶ组C型凝集素进行研究,以阐述C型凝集素在文昌鱼如何通过识别并排除病原体而发挥作用,并进一步确定模式识别受体在文昌鱼天然免疫中的重要地位。 我们从青岛文昌鱼全鱼cDNA表达文库的EST分析中发现了一个编码C型凝集素结构域的cDNA序列。克隆到序列全长,命名为AmphiCTL。经分析确定这是一个编码一个N-末端的信号肽及一个C-末端的C型凝集素结构域的C型凝集素序列。整体结构与脊椎动物的第Ⅶ组C型凝集素一致。 通过realtime-PCR和成体切片原位杂交检测了AmphiCTL的表达模式。在胚胎的发育早期(囊胚、早原肠胚),AmphiCTL的表达量达到顶峰。AmphiCTL在所有组织中均有表达,在肝盲囊中表达量最高,在皮肤和消化道表达量也比较高。在对文昌鱼进行免疫刺激后,发现文昌鱼在革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的感染下却能够引起高达400倍基因表达量上调,酵母聚糖(Zymosan)和酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)刺激后AmphiCTL的表达量提高至70倍。 本文构建了重组融合蛋白表达载体pTRX-AmphiCTL,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了原核表达,并用Ni<2+>-Chelating Sepharose亲和层析柱进行分离纯化,得到较纯的重组融合蛋白。用纯化后的重组蛋白进行功能的初步探索:通过细胞凝集活力测定证实AmphiCTL具有凝集素最基本的功能——红细胞凝集活性;通过糖抑制凝集活性实验证实除葡萄糖在高达150 mM的浓度仍然不能抑制重组蛋白对红细胞的凝集活性外,其余的糖类在适当浓度下均能不同程度抑制蛋白的红细胞凝集活性。通过抑菌圈实验验证了AmphiCTL的对金葡菌的直接杀死作用,我们认为AmphiCTL可能代表了文昌鱼中一种原始的凝集素介导天然免疫形式。
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