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近年来的研究发现,SHARPIN参与肝癌、肾癌、骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的发生发展,提示SHARPIN是一个新的肿瘤相关基因。SHARPIN表达于多种组织和器官,参与调控NF-κB、JNK信号通路、角质形成细胞凋亡等,具有调节炎症、细胞增殖与凋亡等多种生物学功能。目前尚无SHARPIN与皮肤肿瘤发病关系的研究。皮肤基底细胞癌(Basal cell carcinoma,BCC)是人类最常见的皮肤肿瘤,其发病与Hedgehog信号通路有很大关联,Hedgehog信号通路下游分子GLI1和GLI2可以直接调控c-JUN,有研究证实c-JUN在BCC组织中高表达,JUN是JNK信号通路下游信号分子。因此我们提出疑问,SHARPIN是否通过调控经典的JNK信号通路参与BCC的发生发展?本课题拟研究SHARPIN在BCC中所起的功能及其相关的信号通路。研究目的1.明确SHARPIN基因在BCC中的突变情况;2.明确SHARPIN蛋白在BCC组织和细胞株中的表达情况;3.研究SHARPIN表达变化对BCC细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响;4.研究SHARPIN表达变化通过哪些信号通路和分子影响BCC细胞功能。研究内容和方法1.SHARPIN基因突变及表达变化与BCC的相关性研究1)SHRPIN基因在BCC石蜡组织中的突变情况采用PCR对SHARPIN外显子进行扩增,Sanger测序后分析SHARPIN基因的突变情况。2)SHARPIN蛋白在BCC组织中的表达情况采用免疫组化技术,检测SHARPIN蛋白在BCC和正常皮肤中的表达情况;采用Western Blot检测BCC细胞株TE354.T和人永生化角质形成细胞HaCaT中SHARPIN蛋白表达差异;采用免疫荧光检测SHARPIN在BCC组织中的定位。2.SHARPIN对BCC细胞株TE354.T细胞功能的影响1)构建SHARPIN过表达和沉默慢病毒载体,转染TE354.T细胞,采用WB和qRT-PCR检测转染效率;2)利用EdU、CCK-8检测SHARPIN表达变化对细胞增殖的影响;3)利用TUNEL和Annexin V检测SHARPIN表达变化对细胞凋亡的影响;4)利用Transwell检测SHARPIN表达变化对细胞侵袭和迁移的影响。3.SHARPIN表达变化影响细胞功能的分子机制研究1)根据第2部分结果利用WB检测SHARPIN表达变化对细胞功能相关蛋白表达的影响;2)利用WB检测SHARPIN表达变化对JUN和GLI蛋白表达的影响。实验结果1.BCC中SHARPIN基因存在高频突变,突变率达28.1%;SHARPIN蛋白在BCC癌组织中表达降低或丧失;2.SHARPIN低表达可以促进TE354.T细胞的增殖;3.SHARPIN低表达使Cyclin D1和CDK4表达升高;c-JUN表达降低,磷酸化c-JUN表达升高;GLI1表达无明显变化,GLI2表达升高。结论1.SHARPIN在BCC组织中表达显著降低甚至丧失,且存在高频突变,提示SHARPIN在BCC发病中具有肿瘤抑制基因的特征,可作为基底细胞癌鉴别诊断的分子标记;2.SHARPIN低表达可以促进TE354.T细胞的增殖,提示SHARPIN表达下降加快细胞增殖可能是调控BCC发生发展的主要机制;3.SHARPIN低表达促进JUN磷酸化,激活GLI2,从而高表达CyclinD1和CDK4,导致BCC细胞周期的S期细胞比例增多,促进细胞增殖。