水稻种子中mGLp-1短肽高效表达系统建立

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糖尿病以高血糖为特征,可造成多系统代谢紊乱,且发病率呈明显的上升趋势。目前用于治疗糖尿病的药物虽有明显的降血糖效果,但不能从根本上阻止胰岛β细胞的衰退趋势,且人工合成药物对人体的副作用大。  肠促胰岛素(incretin),即胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide1,GLP-1),能够促进胰岛素分泌,抑制胰高血糖素的分泌;促进β细胞再生,减少β细凋亡,对于糖尿病具有标本兼治的作用。但天然GLP-1半衰期极短,被体内的二肽酰基肽酶Ⅳ水解成无活性形式,为了延长其半衰期,科研工作者在保持GLP-1活性的前提下对GLP-1进行了氨基酸置换,得到了mGLP-1(modified GLP-1)。  水稻是理想的生物反应器,在生产外源蛋白及重组蛋白方面应用广泛。目前在水稻中表达mGLP-1已经有成功尝试,但mGLP-1的表达量仍未达到应用要求,且转基因植株中含有选择标记基因,不利于大规模应用。  为进一步提高目的蛋白在转基因水稻中的表达水平,本研究将mGLP-1串联,密码子优化,人工合成10拷贝的mGLP-1(10×mGLP-1)的序列,以东北栽培品种龙稻5为受体材料,利用水稻自身启动子GluC启动子和GluB5终止子,在水稻胚乳中特异高效表达优化的mGLP-1。含6个氨基酸残基(QRLKHN)的OsVSD(vacuolar sorting determinant,VSD),可以指导蛋白质由内质网分选进入PBⅡ(protein bodyⅡ)。我们将Os VSD进一步与目的基因融合,期望OsVSD指导mGLP-1短肽由内质网分选进入PBⅡ。为减轻人们对转基因植物中选择标记基因的顾虑,在载体方面,本实验选用了含有两个T-DNA区的双T植物表达载体,从转基因植株自交分离后代中筛选无选择标记的富含mGLP-1多肽的转基因植株。  通过本实验的探究,在获得的108个mGLP-1转基因植株中共检测到22个高表达mGLP-1的植株,在174个VmGLP-1转基因植株中共检测到24个高表达mGLP-1的植株,在水稻种子中建立了高效表达mGLP-1短肽表达系统。通过对高表达mGLP-1短肽的转基因植株自交分离后代进行筛选,得到了无选择标记的富含mGLP-1短肽的转基因纯系。
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