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锦鲤（Cyprinus carpio L.）具有重要的市场经济价值,目前市场上大多数的锦鲤都是通过杂交选育获得,体色存在较大的变异,市场上具有高经济价值的锦鲤数量较少。因此有必要对锦鲤体色形成的遗传机制进行解析,这也为后期优质锦鲤的选育提供参考数据。目前,人们在黑色素细胞增殖和色素合成等方面获得了较多进展,但在其他非黑色素细胞中的研究较少。模式动物斑马鱼中的碟啶代谢通路已经进行了详细的研究,但是在锦鲤蝶啶色素代谢机制上开展的研究较少。因此,本论文以锦鲤蝶啶代谢通路中的首要限速酶gch1和gch2为研究对象,分析两者在锦鲤体色形成中的表达差异和功能异同,为进一步深入研究蝶啶代谢在锦鲤体色形成中的作用提供参考。Gch作为蝶啶代谢通路的第一个限速酶。有关Gch的研究主要集中在哺乳动物的疾病和生理方面,与体色相关的研究很少有报道。由于硬骨鱼类特有的基因组复制,对体色形成相关的基因也产生了巨大的影响。硬骨鱼类Gch家族存在3个亚型,gch1和gch2在黄/黑色素细胞中有表达,但是两者之间的功能差异及在进化中的作用尚不清晰。为了解析gch1和gch2在锦鲤体色形成中的功能差异,本项目首先对gch1和gch2的序列进行克隆获得c DNA全长,利用荧光定量（quantitative reverse transcription-PCR,q PCR）、蛋白质免疫印迹（western blot）、免疫组织学等方法检测gch1和gch2 m RNA和蛋白在纯红、纯白和红白锦鲤中的表达和定位情况;同时克隆gch1和gch2的启动子序列,利用生物信息学分析其转录起始调控核心元件;随后用Gch抑制剂（2,4-二氨基-6-羟基嘧啶,DAHP）处理锦鲤仔鱼,高通量测序检测DAHP处理组和对照组基因的表达差异。1、锦鲤gch1和gch2克隆、进化及表达分析本章利用RACE技术获得gch1和gch2的c DNA全长序列,构建了两个旁系同源基因的系统进化树,并分析了两个基因的时空表达情况。结果显示:锦鲤gch1开放阅读框（opening read frame,ORF）为756bp,gch2 c DNA全长为1508bp,包含175 bp的5′UTR,610bp的3′UTR及723bp的ORF,编码240个氨基酸。系统进化树比对发现锦鲤gch2首先与斑马鱼gch2聚为一小支,其次是罗非鱼,随后与其他鱼类gch2聚为一大支,锦鲤gch1首先与南极岩斑鲟鱼gch1聚为一小支,随后与其他鱼类具有一大支。gch1和gch2随着锦鲤体色形成表达量先升后降,gch1和gch2在6 dpb表达量显著高于2 dpb和4dpb（P＜0.05）。在纯红色、纯白色锦鲤和皮肤、鳍条和鳞片中,gch1和gch2的表达存在显著差异,经过Spearman分析gch1和gch2具有正相关性。2、三种体色锦鲤组织中的gch1和gch2的表达与定位本章利用克隆获得的gch2 c DNA序列,设计加入Sac I和Bam HI两个限制性酶切位点,成功构建p ET-32a（+）-gch2重组载体,免疫小鼠后,获得多克隆抗体。通过免疫组化检测到gch2在锦鲤红色皮肤真皮层和鳞片上表达,并用western blot确认了目的蛋白的特异性,所获得的重组蛋白大小约为31k Da,双重免疫荧光的结果与q PCR和western blot结果基本一致。红色表皮中gch2的阳性信号高于白色表皮,gch2分布在真皮层的红色皮肤中,白色皮肤的阳性信号较弱,gch1在红色锦鲤鳞片中的表达明显高于红色锦鲤的皮肤,gch1在白色锦鲤的鳞片和表皮中显示出较弱的信号。3、锦鲤gch1和gch2启动子的克隆与分析本章首先克隆锦鲤gch1和gch2启动子序列,经生物信息学分析之后,得到gch1和gch2核心区域位置与Cp G岛具有一定差异。对gch1和gch2启动子区域进行转录因子结合位点预测,分析发现gch1启动子区域中Sp1家族蛋白、C/EBP结合蛋白和AP-2alph转录激活蛋白频率较高,gch2启动子区域中SRY、Sp1家族蛋白和NF-kappa B的结合位点频率较高。然后,对gch1和gch2的转录因子进行了GO和KEGG分析,GO分析显gch1和gch2的转录因子参与了细胞过程、代谢、调节、刺激反应、黑色素细胞分化等多个生物学过程。KEGG分析结果中也包含与色素形成有关的通路,例如黑色素生成途径、Wnt信号通路等,富集在通路中的基因包括参与黑色素形成的tcf712和影响色素细胞分化和沉积的usf1。4、Gch抑制剂（DAHP）处理下锦鲤皮肤组织的比较转录组分析在对照组与DAHP处理组中获得了21278个差异基因（difference expression genes,DEGs）,对DEGs进行GO和KEGG注释,GO注释中昼夜节律、和脂质代谢等信号通路显著富集。KEGG显著富集的通路由“ECM-受体相互作用”,“Adherens连接”和“m TOR信号传导途径”等。差异表达的基因中,tyr,gnai1,wnt7aa,tcf7l1b,tcf7,adcy5,ednrba,adcy2b,ep300a,fzd7b,fzd3b,prkacaa,hrasb,ADCY9,wnt16,camk2g2参与黑色素合成途径（KO04916）。显著下调的基因包括虹彩细胞分化,蝶啶合成,黄色素细胞形成以及类胡萝卜素合成和存储有关的基因,比如ltk,cax1,gch2,plin6等基因。与对照组相比,DAHP处理组中gch2的表达显着下调,gch1的表达水平降低,但与对照组没有显著差异。