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本文以柿叶为原料,研究了柿叶中黄酮类化合物的提取、纯化工艺及抗氧化活性。研究比较了不同提取方法下柿叶黄酮的提取得率,并利用响应曲面法对提取工艺进行了优化,最终确定应用超声波辅助提取、微波辅助提取、超声-微波联合辅助提取三种提取方法,柿叶总黄酮的提取得率分别达到5.58%、6.09%、6.38%。而后运用多种方法对提取出的黄酮类化合物进行了纯化研究,通过大孔树脂富集可以使黄酮纯度提高1.78倍,再经过聚酰胺树脂纯化纯度进一步提高了0.56倍,最后应用逆流色谱进行分离得到了三个组分.并以总抗氧化能力与清除过氧化氢能力为指标考察了三个组分的抗氧化活性。主要研究结果如下:
1、柿叶黄酮提取工艺条件研究
柿叶黄酮提取在单因素试验的基础上,应用响应曲面法优化了超声辅助提取、微波辅助提取及超声-微波联合提取的工艺。
响应曲面法采用Box-Behnken设计方案建立了柿叶黄酮提取得率的二次多项式数学模型,通过计算得到各提取方法的最佳工艺参数,并对模型进行了验证,选取的条件分别为:超声波辅助提取温度80.5℃、超声波功率600W、乙醇浓度70.0%、液料比22:1,黄酮的得率为5.58%;微波辅助提取:微波功率425W、提取时间为20min、液料比20:1,黄酮的得率为6.09%。超声.微波联合提取:微波功率430W、超声波功率590W提取时间为20min、液料比20:1,黄酮的得率为6.38%。
通过比较得知提取得率最高的方法是超声-微波联合提取,其次是微波辅助提取,再次是超声辅助提取。
2、柿叶黄酮纯化方法的研究
采用大孔树脂对提取出的黄酮进行初步纯化。通过静态吸附试验考察10种不同性质的大孔树脂对柿叶黄酮的吸附与解吸能力筛选树脂,最终确定NKA-2大孔树脂为纯化柿叶黄酮较理想的树脂。并对NKA-2树脂纯化黄酮的条件进行优化,优化的工艺分为静态吸附与动态吸附两部分试验。静态吸附试验主要考察样液pH值、吸附时间、解吸乙醇的浓度的影响;动态吸附试验主要从上样浓度、上样流速、上样量、洗脱流速、洗脱终点等方面进行考察。最终得到最佳工艺条件为:以4mg/mL的浓度(溶液pH=3)、2BV/h的速率5BV上样,以5BV的70%乙醇、2BV/h的速率洗脱。经NKA-2大孔树脂处理后的柿叶总黄酮可达52%,纯度提高了1.78倍。
对经大孔树脂富集的柿叶黄酮采用聚酰胺树脂进一步纯化,并对纯化工艺进行优化。通过静态吸附试验考察聚酰胺树脂对柿叶黄酮的饱和吸附容量和解吸率;通过动态吸附试验优化聚酰胺树脂的纯化工艺,优化参数为:样液浓度、上样流速、上样量、洗脱乙醇的体积、浓度,洗脱流速等。所得最佳工艺参数为:聚酰胺树脂对柿叶黄酮静态吸附的饱和吸附容量为126.7mg/g,解吸率为90.2%;动态吸附条件以36.6mg/ml的浓度,上样流速为1BV/h,上样量为2BV,洗脱工艺为以8BV,80%的乙醇洗脱,洗脱流速为1BV/h。按此工艺参数经聚酰胺树脂纯化后,最终得到柿叶总黄酮可达83.1%,纯度提高了0.56倍。
3、采用高速逆流色谱对柿叶黄酮进一步分离纯化
对经聚酰胺树脂纯化的黄酮,采用高速逆流色谱进一步分离。高速逆流色谱分离比较了四种不同溶剂体系的分离效果:通过比较分层时间、上下相体积比对溶剂系统进行初步筛选,再采用分析型逆流色谱对溶剂体系进行快速筛选,最终确定以正己烷:乙酸乙酯;甲醇:水1:0.6:0.6:1的体系对此黄酮类化合物进行分离。并应用制备型逆流色谱对分离条件进行进一步优化,分别测定主机转速在750~950r/min时的固定相保留率:柱温分别为15~35℃时固定相保留率以及不同上样浓度下的分离效果,最终确定的最佳操作参数为转速800r/min,柱温30℃、上样浓度24mg/ml、检测波长214nm,按此条件应用高速逆流色谱对柿叶黄酮类化合物进行分离,可得到三个组分。经高效液相色谱检测组分1含有三种物质,组分2含有两种物质,组分3较纯。
4、抗氧化活性研究
分别考察了三个组分的总抗氧化能力与清除过氧化氢的能力,结果表明组分1、2的抗氧化能力比抗坏血酸强,组分3的抗氧化能力弱于抗坏血酸。