热应激是家禽生产中常见的应激源,肉鸡等家禽因为皮肤无汗腺且体表覆盖羽毛,在规模化高密度饲养条件下,常因受到高温热应激而猝死,带来巨大的经济损失。随着对热应激的研究不断深入,发现热应激诱导心肌细胞凋亡造成心肌损伤是家禽热应激猝死的原因之一。因此,抑制心肌细胞凋亡在减轻心肌细胞热应激损伤,维持心脏正常功能和降低热应激损失方面具有重要意义。在日粮中添加抗氧化剂是目前研究较多的缓解热应激的方法。锰（Mn）作为锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的组成成分,是家禽的必需微量元素,其抗氧化效果的研究相对成熟,但是有关Mn对热应激诱导细胞凋亡的作用方面,认识还非常欠缺,Mn是否具有进一步调节氧化应激诱导的细胞凋亡的功能及其作用机制尚不清楚。本研究以肉鸡鸡胚为材料,进行如下研究:1)通过原代鸡胚心肌细胞的分离培养,建立热应激诱导心肌细胞凋亡的体外模型;2)通过CCK-8、流式细胞术、RT-qPCR、western blot等检测方法研究Mn在热应激诱导的细胞凋亡中的调控作用并探讨其潜在的作用机制;3)借助数据独立采集（data-independent acquisition,DIA）蛋白质组测序技术和生物信息学分析对热应激处理和Mn处理的原代心肌细胞中的蛋白质进行差异表达分析和功能富集分析,筛选出Mn参与调控心肌细胞凋亡的关键蛋白。上述研究为更合理使用Mn及其添加剂,从营养途径更准确地调节热应激诱导的心肌细胞凋亡和减少热应激对肉鸡生产的不良影响提供了科学依据。研究的主要结果如下:1.成功分离培养鸡胚原代心肌细胞,经免疫组化和支原体检测,证明获得的原代心肌细胞纯度高、活力好且无污染。心肌细胞经不同时间的热应激处理后,表现出不同程度的活性下降,细胞凋亡率呈时间依赖性显著增加,由此,成功构建了热应激诱导原代心肌细胞凋亡的时间模型。Caspase酶活性检测显示热应激诱导的原代心肌细胞凋亡是Caspase蛋白依赖性凋亡,并且凋亡涉及死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径。心肌细胞热应激4 h后,其细胞活力、细胞凋亡率、Caspase酶活性均发生显著变化,故将4 h作为后续试验研究的热处理时间。2.为了研究Mn对热应激诱导细胞凋亡的潜在影响,我们利用经Mn预处理24 h的原代心肌细胞,在热应激条件下研究了相关的关键因素。结果表明,Mn能恢复热应激引起的细胞活力下降,并降低Caspase-3活性（P＜0.05）,减少热应激诱导的细胞凋亡,且其抗凋亡效果存在剂量差异,随着锰浓度的增加,抗凋亡效应呈现出先增强后减弱的变化趋势,在Mn浓度为20μM时效果最为显著,因此,20μM是Mn抗热应激凋亡的最佳作用浓度。但有机态锰和无机态锰在降低细胞凋亡方面无显著差异。RT-qPCR、western blot和流式细胞术分析表明Mn有助于降低热应激下细胞P53基因表达、增加Bcl-2/Bax比值,Mn预处理组的细胞线粒体膜电位（Δψm）和细胞内ATP含量的抑制被显著逆转（P＜0.05）。此外,Mn抑制热应激诱导的线粒体裂变,表现为线粒体裂变相关蛋白Drp1基因表达减少,线粒体融合相关蛋白Opa1和Mfn1的基因表达增加（P＜0.05）。Mn处理显著降低了内质网应激标记基因GRP78和CHOP的表达水平（P＜0.05）,反映出Mn有助于缓解热应激引发的内质网应激。活性氧（ROS）的抑制试验表明,热应激造成细胞内产生过量的ROS,触发胞内Ca2+浓度发生变化,进而激发细胞释放凋亡信号是导致心肌细胞凋亡的重要因素,ROS是热应激诱导细胞凋亡的关键介导物。Mn通过增强Mn-SOD的表达和活性,减少细胞内ROS的含量,降低Ca2+浓度变化幅度,从而发挥抗凋亡作用。皮尔森（Pearson）相关性分析也显示,ROS累积与细胞内Ca2+浓度显著相关,且二者与凋亡基因Bax、内质网应激基因GRP78和线粒体膜电位（Δψm）均呈显著相关性（P＜0.05）。过表达和抑制Opa1基因证实,在热应激状态下,下调细胞Opa1的表达,促进了线粒体内Cyt-C的释放,Mn可以促进Opa1的表达,但对Cyt-C的释放无影响,因此认为Mn更多的通过调节线粒体动力平衡,而不是Opa1/Cyt-C抗凋亡通路来发挥抗凋亡作用。3.利用DIA蛋白质组测序技术,在CON vs HS中鉴定到差异表达蛋白（DEPs）437个（161个上调,276个下调）,HS vs HS+MnCl2中鉴定到DEPs 93个（30个上调,63个下调）,HS vs HS+Mn-AA中鉴定到DEPs 121个（51个上调,70个下调）,HS+Mn-AA vs HS+MnCl2中鉴定到DEPs 53个（20个上调,33个下调）。以western blot数据验证显示DIA获得的蛋白组数据是可靠的。GO和KEGG功能分析显示,DEPs主要参与细胞成分或组织的代谢、生物调控、刺激反应、定位、发育、细胞信号、免疫系统等生物过程。根据生物信息学分析,筛选出Mn调控热应激心肌细胞凋亡的关键DEPs 5个,分别是BAG3、AIFM1、RPA3、DNAJB1和GLTSCR2,Mn通过这些关键基因调控DNA复制、DNA修复和内质网的蛋白质合成,最终影响细胞对热刺激的反应和细胞凋亡。综上所述,本研究在体外构建了热应激诱导的鸡胚原代心肌细胞凋亡模型,通过一系列试验研究证实,Mn具有抗凋亡作用。Mn通过增强抗氧化酶Mn-SOD的表达和活性,减少细胞内ROS的含量,降低Ca2+浓度,缓解热应激诱导的内质网途径和线粒体途径细胞凋亡。利用DIA质谱测序技术,筛选与热应激反应、细胞凋亡相关的DEPs,得到参与Mn调控热应激心肌细胞凋亡的关键DEPs 5个。研究结果为进一步从矿物质营养途径减少热应激造成的伤害提供了重要参考。