第一部分90例儿童噬血细胞综合征临床研究研究目的总结分析儿童HLH的临床表现、实验室检查特征及治疗、疗效、转归等，为修订HLH的诊治方案提供临床研究资料。研究内容回顾性分析2008年12月至2014年4月在我院住院，符合“HLH-2004”诊断标准的90例HLH患儿的临床资料，总结其临床表现、实验室检查特征及治疗、疗效、转归等，观察其临床特征及其与病因、病情和预后的关系。研究方法1．临床观察包括：①一般资料：年龄、性别；②家族史；③症状：有无发热，热峰，热程，有无伴随其他临床表现；④体格检查：肝脾大小、浅表淋巴结大小、皮肤黏膜情况（有无黄染、皮疹等）；⑤实验室检查：血常规、凝血功能、肝功能、血清铁蛋白、甘油三酯、骨髓细胞涂片、NK细胞绝对计数及比例。2．治疗方案参考国际组织细胞协会“噬血细胞综合征2004指南”（以下简称“HLH-2004”），以环孢素A（CSA）、地塞米松（DEX）和依托泊苷（VP-16）联合化疗，分为初始治疗及维持治疗两个阶段，疗程共24周。对于合并多器官功能障碍综合征（MODS）的危重或极危重患儿，进行血浆置换治疗后再予化疗。3．评估方法根据“HLH-2004”方案中的疗效评估标准，分为临床反应(CR)、疾病缓解(NAD)、疾病活动(AD)和疾病再活动(RD)。4．统计分析应用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析，当样本量＞50时采用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性分析，p值＞0.1表示符合正态分布。采用Levene检验对数据进行方差齐性分析， p值＞0.1表示方差齐。当符合正态分布且方差齐性时选用t检验；当不符合正态分布且方差不齐时选用Mann-Whitney秩和检验。研究结果1．90例HLH患儿中，男50例（55.56%），女40例（44.44%）；初诊年龄0.22~13.10岁，中位年龄1.89岁，78.89%的病例集中在1~5岁年龄段。2．90例HLH患儿确诊时，主要的临床表现为发热（100.00%）、肝大（98.89%）、脾大（84.44%），其余临床表现依次为浅表淋巴结肿大（62.22%）、呼吸系统症状（41.11%）、黄疸（35.56%）、皮疹（23.33%）、消化系统症状（13.33%）和中枢神经系统症状（5.56%）。3．90例HLH患儿确诊时，主要的实验室检查结果依次为SF升高≥500μg/L（100.00%），外周血两系或以上血细胞减少（96.67%），骨髓发现噬血细胞现象（87.78%），TG升高≥3.0mmol/L（76.67%），FIB降低≤1.5g/L（54.44%）。此外，NK细胞绝对计数及比例均降低者83.08%（54/65），仅NK细胞绝对计数降低及仅NK细胞比例降低者均为7.69%（5/65及5/65）。4．90例HLH患儿治疗情况如下：48例（53.33%）接受化疗，其中1例因经济原因仅使用地塞米松化疗，2例因家庭原因仅使用地塞米松及环孢素化疗，余45例确诊后使用“HLH-2004”方案化疗；24例（26.67%）因病情需要行血浆置换治疗；6例（6.67%）仅予抗感染及对症支持治疗；12例（13.33%）因经济原因放弃治疗。5．转归：本组90例患儿中，NAD56例，AD2例，RD5例，死亡13例，放弃治疗及失访19例。90例总的NAD率为62.22%，确诊后即予“HLH-2004”治疗的患者，NAD率为93.33%；血浆置换后化疗的患者，NAD率为66.67%；血浆置换后不化疗的患者，NAD率为22.22%；值得注意的是，2例因家庭原因诊断后仅使用地塞米松及环孢素A治疗8周，时评估达NAD，目前分别处于持续NAD状态20周及29周。结论1．本组90例HLH患儿中，出现频率排前三位的临床表现是发热、肝脾淋巴结肿大及呼吸系统症状，实验室检查则是血清铁蛋白升高、外周血两系或以上减少和骨髓发现噬血现象。2．在诊断HLH时，NK细胞绝对计数及比例不能取代NK细胞活性。3．总疗程24周的化疗方案可使儿童HLH的NAD率达93.33%，值得进一步研究。4．血浆置换后化疗的NAD率为66.67%，提示血浆置换对于重症HLH具有积极的治疗价值。第二部分90例儿童噬血细胞综合征的病因学探讨研究目的通过对90例HLH患儿的病因进行系统、全面的总结、分析，结合患儿临床特征、治疗反应、转归等，初步探讨pHLH基因检测及其临床意义；对HLH患儿的病原学分布特点进行总结，以期为临床判断儿童HLH的治疗反应、预后提供一定的指导。研究内容包括pHLH相关基因PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、SH2D1A、XIAP、LYST、RAB27A、AP3B1的测序结果分析；病原学分布特点分析；自身免疫病相关指标分析；肿瘤学相关指标分析；遗传代谢病相关指标分析。研究方法1．pHLH相关基因检测定性PCR扩增PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、SH2D1A、XIAP、LYST、RAB27A、AP3B1基因，并对各基因扩增产物进行测序，分析其是否存在突变、缺失或插入等。2．病原学检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测EBV病毒抗体（EBVCA-IgM、EBVCA-IgG、EBVEA-IgG、EBVNA-IgG），以及风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒的IgM抗体，嗜肺军团菌1型IgM抗体，弓形虫IgM抗体。采用荧光定量PCR检测血浆中EBV-DNA负荷量。所有患儿均常规检测结核抗体IgG并进行结核菌素试验；采用微生物培养及药敏试验对血液、骨髓液、痰液等标本进行细菌培养及药敏试验。采用间接免疫荧光法同时检测肺炎支原体、Q热立克次体和肺炎衣原体的IgM抗体。3．肿瘤学相关检查包括胸部、腹部、骨骼和/或头颅影像学检查排除占位性病变；血、尿β2微球蛋白、癌胚抗原、甲胎蛋白、癌抗原-125、癌抗原-199等肿瘤标志物检测；骨髓细胞形态检查排除肿瘤细胞浸润。4．自身免疫性疾病相关检查采用ELISA方法检测免疫球蛋白IgG、IgE、IgM、IgA；自身抗体（抗核抗体、抗nRNP抗体、抗Smith抗体、干燥综合症-A抗体、干燥综合症-B抗体、抗Scl-70、抗Jo-1、抗着丝点抗体、抗双链DNA抗体、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体、抗核糖体P蛋白抗体等12项）；血管炎抗体（核周型ANCA、胞浆型ANCA、髓过氧化物酶抗体、蛋白酶3抗体等4项）；类风湿因子IgG。5．遗传代谢病相关检查采用气相色谱-质谱联用（GS-MS）方法检测血浆氨基酸谱及尿有机酸；采用串联质谱法检测血酰基肉碱；采用免疫透射比浊法检测铜蓝蛋白。研究结果1．本研究对20例HLH患儿进行了pHLH相关基因检测，基因突变总的检出率为100%，各基因突变检出率由高到低依次为PRF1及STXBP（2均为90%）、UNC13D（60%）、AP3B1（55%）、XIAP（40%）、SH2D1A（20%）、RAB27A（15%）、STX11及LYST（均为10%）。2．本研究共检出85种基因突变，其中6种目前文献尚未见报道，分别为UNC13D基因错义突变c.1831G>A；STXBP2基因错义突变c.593C>T及c.613G>A；LYST基因错义突变c.5290G>A；AP3B1基因错义突变c.362C>T；RAB27A基因错义突变c.35T>C。3．本组病例中，病原类型按检出率高低排序为：EBV-IgM阳性率64.44%（58/90）、细菌培养阳性率20.51%（16/78）、CMV-IgM阳性率19.77%（17/90）、肺炎支原体IgM阳性率16.47%（14/85）、单纯疱疹病毒IgM阳性率9.30%（8/86）。结论1．存在c.1232G>A、c.368A>G突变的患儿，其病情重，进展快，死亡率高；存在c.1033C>T、c.613G>A突变的患儿，治疗早期的反应较差。2．EBV感染是儿童HLH最常见的触发因素。EBV-HLH病情较重，死亡率较高，预后较差，且预后与EBV DNA负荷量相关。3．在重症/死亡病例中，2例pHLH相关基因突变与EBV感染共存，两者在病情发生、发展过程中的主次关系、因果关系有待进一步研究。