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第一章胆囊癌细胞株上皮-间质转化(EMT)前后的差异基因表达分析目的：应用基因芯片技术比较胆囊癌细胞株GBC-SD经转化生长因子β1(TGF-β1)诱导发生上皮-间质转化(EMT)前后的差异基因表达,为进一步探讨胆囊癌侵袭转移机制提供实验依据。方法：培养胆囊癌细胞株GBC-SD,选取TGF-β1浓度分别为Ong/ml、0.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml,诱导48h或72h后提取各组细胞总RNA,经逆转录PCR(RT-PCR)检测上皮(钙粘素CDH1)及间质(波形蛋白VIM)标志物,然后选取EMT发生最理想的一组细胞。提取该组细胞及未经诱导的胆囊癌细胞株GBC-SD的总RNA,纯化后进行荧光标记,在含有21522个Oligo DNA的晶芯(?)人基因组寡核苷酸芯片上进行杂交,用LuxScan10KA双通道激光扫描仪进行扫描,根据荧光强度筛选出两者的差异基因,最后用在线分子注释系统(MAS2.0)进行生物信息学分析。结果：成功地进行了基因芯片实验,共筛选出265个差异表达基因,167个基因在经TGF-β1诱导后的胆囊癌细胞中表达上调,98个基因表达下调,将这些基因进行GO分类,发现其功能主要涉及细胞周期,有丝分裂,DNA复制等；信号通路分析则显示主要涉及细胞周期信号通路,细胞粘附分子信号通路,p53通路,MAPK通路等。结论：利用TGF-β1对胆囊癌细胞进行诱导后,细胞发生了EMT;通过基因芯片监测TCF-β1诱导前后胆囊癌细胞基因表达变化，筛选出265个差异表达基因，其中上调基因167个，小调98个。差异表达基因涉及多种功能蛋白和信号通路。第二章FGFBP1、WISP2mRNA及其蛋白在慢性胆囊炎及胆囊癌组织中的表达目的：通过逆转录PCR (RT-PCR)、Western blot技术在mRNA和蛋白水平检测成纤维细胞生长因子(FGFBP1)和Wnt-1诱导分泌蛋白2(WISP2)在慢性胆囊炎和胆囊癌组织中的表达情况。方法：收集胆囊癌及慢性胆囊炎新鲜组织标本各15例,提取组织的总RNA及总蛋白,然后进行RT-PCR及Western blot实验。结果：胆囊癌组织中FGFBP1mRNA的相对表达量为0.778±0.082,而慢性胆囊炎中的表达则为0.467±0.081,mRNA表达水平存在显著性差异(P<0.01)；其蛋白的表达水平则是0.851±0.069vs0.526±0.063,两者表达水平存在显著性差异(P<0.05)。WISP2mRNA在胆囊癌中的表达较慢性胆囊炎显著下调(0.202±0.046vs0.764±0.015,P<0.01)；同时其蛋白的表达水平也显著下调(0.454±0.056vs0.848±0.078,P<0.01)。结论：1.FGFBP1在胆囊癌组织中的mRNA及其蛋白表达较慢性胆囊炎组织明显上调。2.WISP2在胆囊癌组织中的mRNA及其蛋白表达较慢性胆囊炎组织明显下调。第三章RNA干扰技术抑制FGFBP1基因表达对胆囊癌细胞生物学特性的影响目的：构建针对FGFBP1的干扰载体,通过RNA干扰技术沉默FGFBP1基因,探讨FGFBP1对胆囊癌细胞体外增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法：将构建的3组干扰载体(FGFBP1-RNAi-1,2,3)及无关序列RNAi-NC转染到胆囊癌细胞GBC-SD中,以无关序列RNAi-NC转染组及未转染组细胞为对照组,通过荧光倒置显微镜观察转染效率,选取干扰载体中转染效率最高的组别；提取干扰载体组、无关序列组及未转染组细胞总RNA和总蛋白后,检测FGFBP1mRNA和蛋白表达水平。应用MTT细胞增殖实验,Transwell小室实验及划痕实验,研究FGFBP1基因沉默后胆囊癌细胞的体外增殖、侵袭及迁移能力的变化。结果：1.各质粒转染组均可见绿色荧光,而未转染的阴性对照组无荧光显示,说明转染成功,其中FGFBP1-RNAi-1组转染效率最高(约为75%),选取该组进行后续实验。2.转染FGFBP1-RNAi-1组,FGFBP1mRNA及其蛋白表达量(0.134±0.036,0.147±0.043)明显低于转染RNAi-NC无关序列组(0.783±0.100,0.881±0.052)及未转染组(0.782±0.084,0.862±0.062),均有差异显著性(P<0.01)。未转染组与转染RNAi-NC无关序列组比较无显著性差异(P<0.05)。3.FGFBP1-RNAi-1转染组细胞于转染24小时后的OD值均较RNAi-NC转染组和未转染组显著减低(P<0.01),而转染RNAi-NC无关序列组和未转染组细胞的体外增殖活性无明显差异(P>0.05)。4.FGFBP1-RNAi-1转染组穿膜细胞数(46.5+4.7)明显低于转染RNAi-NC无关序列组(75.8土5.4)及未转染组(77.8+5.5),具有显著性差异(P<0.01)。而转染RNAi-NC无关序列组及未转染组相比,穿膜细胞数无明显差异(P>0.05)。5.各组细胞在转染48小时后进行划痕处理,并于划痕后0小时及48小时在倒置相差显微镜下观察并拍照。划痕后48小时观察,三组细胞均向划痕区迁移,其中未转染组及RNAi-NC无关序列转染组的划痕区基本消失,而FGFBP1-RNAi-1转染组则仍残留部分划痕区,显示出明显差异。结论：1.成功构建及转染针对FGFBP1基因的干扰表达载体FGFBP1-RNAi。2.RNA干扰沉默胆囊癌细胞GBC-SD中FGFBP1的表达后,能够抑制胆囊癌细胞的体外增殖以及迁移、侵袭能力。第四章胆囊良恶性病变组织中FGFBP1和WISP2的表达及临床病理意义目的：研究FGFBP1及WISP2在胆囊良恶性组织中的表达情况,探讨FGFBP1及WISP2在胆囊癌发生、进展、生物学行为及预后中的意义。方法：应用Envision免疫组织化学染色方法检测FGFBP1及WISP2在胆囊腺癌(n=108)、癌旁组织(n=46)、腺瘤(n=30)、息肉(n=15),慢性胆囊炎(n=35)中的表达情况及其临床病理意义。结果：1.FGFBP1在胆囊腺癌中的阳性表达率(57.4%)明显高于癌旁组织(32.6%)、腺瘤(20.0%)、息肉(20.0%)以及慢性胆囊炎(11.4%),均具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)；而WISP2的表达则相反(P<0.05或P<0.01)。此外,FGFBP1阳性表达或(和)WISP2阴性表达的胆囊良性病变的上皮组织均出现不同程度的不典型增生。2.低分化腺癌,肿块最大径≥2cm,伴有淋巴结转移,周围组织侵犯的病例中FGFBP1的阳性表达率显著高于高分化腺癌,肿块最大径<2cm,无淋巴结转移及周围组织侵犯的病例(P<0.05或P<0.01)；而WISP2的表达则与FGFBP1相反。且FGFBP1与WISP2的表达存在高度不一致性(P<0.01)。3. Kaplan-Meier单因素生存分析发现,肿瘤分化程度越低,肿块最大径≥2cm,伴淋巴结转移和周围组织侵犯,以及FGFBP1阳性表达和WISP2阴性表达等因素均与更短的生存期密切相关(P<0.05或P<0.01)。此外,FGFBP1(-)WISP2(+)表达亚型患者生存期较其他三组更长,预后最好；而FGFBP1(+)WISP2(-)表达亚型组患者生存期最短,预后最差。多变量COX回归分析显示FGFBP1表达阳性与患者术后生存率呈负相关,是危险因素；WISP2阳性表达与术后生存率呈正相关,是保护因素,它们均为独立的预后因子。结论：FGFBP1、WISP2表达水平从相反的方面反映了胆囊癌的临床生物学行为及预后,WISP2阳性者预后比较好,而FGFBP1阳性表达者预后则较差。