创伤修复过程是多种生长因子协调的时空控制过程。应用外源性生长因子在组织修复过程中显示了较好的应用前景,但是实现生长因子的时空控制,进而实现创伤组织的再生修复,仍然存在着巨大的挑战。组织工程方法的出现,为解决组织修复提供了一个新的途径。构建具有时空控制释放特点的载生长因子组织工程支架已成为一个新的研究方向。时空控制释放生长因子体现了生长因子释放的两个特点：1.所释放的生长因子聚集与创伤组织局部,作用于相应的靶组织和细胞,并避免释放于周围组织引起的不可预期结果；2.生长因子释放应该持续足够长的时间,满足组织再生修复的需求。生长因子的释放与支架材料的结构存在一定的相关性。通过调整支架材料的疏松或致密结构,可以改变所负载生长因子的释放行为。据此,本研究设计制备一种具有双侧疏松或致密程度不同的双层结构材料,以期通过材料的结构差异调整生长因子的释放行为,实现所负载生长因子的时空控制释放。并将所制备材料应用于传统的治疗方法如软骨下钻孔术、微骨折、自体骨软骨镶嵌成型术和自体软骨细胞移植术等难以实现有效修复的的创伤软骨组织。1.研究中选用胶原材料为主要原材料构建组织工程支架。由于碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)是体内最有效的有丝分裂原之一,对软骨细胞、间充质干细胞有显著的促有丝分裂作用。此外,bFGF还具有促进未分化间充质细胞向软骨细胞方向分化、促血管增生作用。因此,选用bFGF为模型生长因子。研究中将载有bFGF的纳米颗粒负载于双侧致密程度不同的胶原膜材料之间,进而获得复合支架材料。并对材料进行体外释放行为、体外细胞培养以及关节软骨修复的研究。具体研究内容包括：制备一种复合负载bFGF的壳聚糖-肝素(CS-Hep)纳米粒子的双层胶原基复合材料,双层胶原膜分别采用冷冻干燥法和风干法制备,分别命名为CFM和CAM,对其进行扫描电镜和红外表征；采用流池法,考察复合材料在PBS和胶原酶溶液两种不同释放介质中对模型蛋白HSA的释放行为,同时应用激光共聚焦显微镜观察异硫氰酸荧光素(FITC)标记的HSA在PBS溶液中的释放情况。2.体外培养L-929细胞,分别接种于复合bFGF双层胶原基复合材料(bDM)和未复合bFGF双层胶原基复合材料(DM)以及交联的冻干胶原膜(CFM)表面,用四甲基偶氮唑盐微量反应比色法(MTT)法、激光共聚焦显微镜观察细胞在第3、5天的粘附和增殖的情况。3.制备bFGF/双层胶原基复合材料浸提液,进行急性全身毒性试验、溶血试验、热原试验和细胞毒性试验,对材料进行生物安全性评价。4.选取60只家兔,随机分成5组bDM-CFM (bDM材料CFM朝向软骨下骨面)组、bDM-CAM (bDM材料CAM朝向软骨下骨面)组、DM-CFM (DM材料CFM朝向软骨下骨面)组、DM-CAM (DM材料CAM朝向软骨下骨面)组、假手术对照(单纯缺损不加干预)组。于兔双侧膝关节构建软骨缺损模型,将材料分别按CFM和CAM层朝向软骨下骨面植入缺损处,术后1、2、4、8、12、16周采集标本,通过大体观察、组织学评分、免疫组化检测Ⅱ型胶原,分析不同处理组软骨修复的情况。并在上述实验的同时,于第3d、1w、2w、4w、8w分别抽取关节液,用抗体芯片检测20种相关生长因子、细胞因子及炎性趋化因子的时间变化情况。实验结果表明,bFGF/双层胶原基复合材料两侧疏松程度差异明显。在体外释放实验中,释放液为PBS时,CAM→CFM释放百分率高；而在胶原酶释放液中,CFM→CAM组释放百分率高,FITC标记的HSA释放实验显示双层材料对于蛋白分子具有不均一的释放特点。这些结果提示,所构建的支架材料对生长因子具有时空控制性释放特点。在体外细胞培养实验中,所有材料均显示良好的细胞粘附和促增殖作用,同时包载bFGF组细胞增殖率较相应未包载bFGF组更高(P<0.05)。包载bFGF材料由于结构的差异导致bDM-CFM层更有利于细胞粘附和增殖(P<0.05),这可能与bDM-CFM对生长因子有时空控制释放特性有关；激光共聚焦显微镜观察结果也证实了这一观点。生物学评价研究发现,bFGF/双层胶原基复合材料浸提液pH值为6.55±0.13,接近中性；急性全身毒性试验、热原试验、溶血试验均为阴性,细胞毒性为0级,说明本材料具有良好的生物安全性,对机体无毒,对细胞有较强的亲和作用。关节软骨修复过程中,对不同时期关节液中生长因子、细胞因子及炎性趋化因子进行抗体芯片检测,结果表明因材料结构不同而引起的生长因子释放不同可导致被检因子表现出不同的时间变化过程；在家兔膝关节缺损修复实验中,bDG-CFM较其余组能更好地修复软骨缺损。在16周时缺损已完全被填充,与缺损周围组织的界限已较难辨认,修复组织内细胞形态与周围正常软骨一致,说明bDG-CFM的结构和因子释放特点有利于软骨缺损修复。