研究背景：目前随着我国经济的发展和人口老龄化的加剧,我国恶性肿瘤死亡率增长趋势极为明显,目前已经成为我国人民的首要死亡原因,在对广大人民群众的健康造成了极大的危害的同时,也对社会经济的发展造成了沉重的负担。作为一种原发于男性前列腺的上皮性恶性肿瘤,前列腺癌在欧美国家一直是最常见的男性泌尿生殖系统恶性肿瘤之一,发病率相当高,最近几年的调查数据显示在美国的恶性肿瘤致死率统计中,前列腺癌的致死率已经超过肺癌居男性癌症致死率中居第1位。近年来我国的前列腺癌发病率呈逐年递增趋势,并且递增趋势十分明显,目前在七十岁以上老年中国男性中前列腺癌发病率高居所有泌尿生殖系统第一位,在我国前列腺癌已正式成为严重影响男性健康的的癌症之一。目前大多数前列腺癌患者在确诊时已发生转移或进入晚期。紫杉醇类药物是临床上用于治疗前列腺癌的一线药物,但是超过半数的前列腺癌晚期患者在接受现有的化疗药物治疗后,很快会出现耐药性,而不得不采用其他的姑息治疗方法,但是这些治疗方法其临床效果也不理想。而紫杉醇耐药机制复杂,现有的学说均不能很好地解释其耐药机制,因此探索新的紫杉醇耐药机制和治疗手段显得十分迫切和重要。在前期研究中本课题组合作成员通过逐步增加紫杉醇浓度已经成功构建前列腺肿瘤紫杉醇耐药细胞株PC3-TxR, DU145-TxR,并且证明具有稳定的耐药性。近期我们发现耐药细胞的形态与亲本的PC3, DU145细胞相比较发生较大变化,PC3-TxR, DU145-TxR细胞较为松散,细胞形态更为狭长,并且呈梭形,提示我们可能在耐药细胞株中有EMT的发生。本实验拟以这两种耐药细胞及其亲本细胞为模型,探讨上皮细胞间充质转化及调控其发生的信号通路与前列腺癌紫杉醇耐药之间的联系,以期阐明前列腺癌紫杉醇耐药发生发展机制,并为临床治疗提供新的思路和治疗策略。研究内容包括以下三个部分：第一部分：紫杉醇诱导的前列腺癌耐药细胞株EMT特征分析目的：通过与亲本前列腺肿瘤细胞PC3, DU145相比较,证实其耐药细胞株PC3-TxR, DU145-TxR中是否有EMT发生。方法：1.倒置显微镜下观查对数生长期的亲本肿瘤细胞PC3, DU145及其耐药细胞PC3-TxR, DU145-TxR之间的形态差异,并拍照；2.应用RT-PCR, Real-time PCR, Western-blot等方法检测已知的EMT相关标记物E-cadherin, N-cadherin, Vimentin等在亲本肿瘤细胞PC3,DU145及其耐药细胞PC3-TxR, DU145-TxR之间的表达差异；3.采用划痕实验实验,Transwell小室实验检测亲本细胞PC3, DU145及其耐药细胞PC3-TxR, DU145-TxR之间迁移和侵袭能力差异；4.通过采用慢病毒转染技术,构建荧光素酶转染的亲本PC3, DU145细胞及其耐药细胞PC3-TxR, DU145-TxR,构建成功以后,皮下注射到6周龄雄性SCID小鼠体内,随时观测成瘤情况,小动物活体成像系统检测小鼠体内成瘤能力差异；结果：1.和亲本PC3, DU145细胞相比较,耐药细胞PC3-TxR, DU145-TxR形态狭长、呈梭形,细胞之间更为疏散,呈间充质样形态改变；2.与亲本PC3, DU145细胞相比较,耐药细胞PC3-TxR, DU145-TxR中E-cadherin表达明显下调,同时Vimentin, Snail, N-cadherin表达上调；3.DU145细胞24小时的细胞迁移率为15.9±3.20%, DU145-TxR细胞24小时的细胞迁移率为68.6±2.85%,DU145-TxR细胞的迁移能力强于其亲本细胞DU145(P<0.01)。Transwell实验显示PC3-TxR细胞24小时的侵袭和迁移能力明显强于亲本PC3细胞(P<0.01)；同样DU145-TxR细胞24小时的侵袭和迁移能力也强于亲本DU145细胞(P<0.01);4.成功构建荧光素酶转染的四种细胞株：PC3-luc, PC3-TxR-luc, DU145-luc, DU145-TxR-luc,荧光酶活性指数分别为：3.70×107,9.30 ×107,2.90 X 107,22× 107; PC3-TxR-luc细胞肿瘤体积明显大于PC3-luc细胞(P<0.01)；结论：与亲本前列腺肿瘤细胞相比较,耐药细胞确实有EMT现象；并且耐药细胞的迁移,侵袭以及体内成瘤能力均强于亲本细胞。1.和亲本PC3, DU145细胞相比较,耐药细胞PC3-TxR, DU145-TxR形态狭长、呈梭形,细胞之间更为疏散,呈间充质样形态改变；2.与亲本PC3, DU145细胞相比较,耐药细胞PC3-TxR, DU145-TxR中E-cadherin表达明显下调,同时Vimentin, Snail, N-cadherin表达上调；3.DU145细胞24小时的细胞迁移率为15.9±3.20%, DU145-TxR细胞24小时的细胞迁移率为68.6±2.85%,DU145-TxR细胞的迁移能力强于其亲本细胞DU145(P<0.01)。Transwell实验显示PC3-TxR细胞24小时的侵袭和迁移能力明显强于亲本PC3细胞(P<0.01)；同样DU145-TxR细胞24小时的侵袭和迁移能力也强于亲本DU145细胞(P<0.01);4.成功构建荧光素酶转染的四种细胞株：PC3-luc, PC3-TxR-luc, DU145-luc, DU145-TxR-luc,荧光酶活性指数分别为：3.70×107,9.30 ×107,2.90 X 107,22× 107; PC3-TxR-luc细胞肿瘤体积明显大于PC3-luc细胞(P<0.01)；结论：与亲本前列腺肿瘤细胞相比较,耐药细胞确实有EMT现象；并且耐药细胞的迁移,侵袭以及体内成瘤能力均强于亲本细胞。第二部分E-cadherin对前列腺癌细胞耐药性以及迁移、侵袭、克隆形成能力的影响目的：构建E-cadherin沉默/过表达的细胞及其空载对照细胞,同时检测构建成功细胞和其亲本细胞之间细胞功能学及形态学之间的差异以及对紫杉醇敏感性的差异,探索EMT在前列腺肿瘤耐药机制中的作用。方法：1.应用慢病毒转染技术,构建E-cadherin过表达的前列腺肿瘤耐药细胞PC3-TxR-E-cadherin,DU145-TxR-E-cadherin稳定转染细胞株以及空载对照细胞株PC3-TxR-control, DU145-TxR-control,病毒液转染48小时以后,加入嘌呤霉素筛选直至阴性对照组细胞全部死亡。Real-time PCR, Western-blot检测E-cadherin表达,同时Western-blot检测和EMT相关的标记物以及和EMT相关的信号通路的表达。2.划痕实验,Transwell小室实验检测E-cadherin过表达细胞株和空载细胞株以及亲本耐药细胞株之间迁移,侵袭能力的差异,MTS法检测E-cadherin过表达细胞株和空载细胞株以及亲本耐药细胞株对紫杉醇敏感度的差异。3.应用siRNA干扰技术,构建E-cadherin瞬时沉默的的前列腺肿瘤细胞转染细胞株PC3-si-E-cadherin, DU145-si-E-cadherin以及空载对照细胞株PC3-si-control, DU145-si-control,转染48小时以后,提取mRNA及蛋白,然后Real-time PCR, Western-blot检测E-cadherin表达,同时Real-timePCR检测和EMT相关的标记物以及和Notch-1信号通路的表达。4.划痕实验,克隆形成实验检测E-cadherin沉默细胞株和空载细胞株以及亲本细胞株之间迁移,克隆形成能力的差异,MTS法检测E-cadherin沉默细胞株,空载细胞株以及亲本细胞株对紫杉醇敏感度的差异。结果：1.成功构建E-cadherin过表达的前列腺肿瘤耐药细胞PC3-TxR-E-cadherin, DU145-TxR-E-cadherin稳定转染细胞株以及空载对照细胞株PC3-TxR-control, DU145-TxR-control,和亲本细胞相比较PC3-TxR-E-cadherin,DU145-TxR-E-cadherin中E-cadherin表达明显升高,同时PC3-TxR-control,DU145-TxR-control和亲本细胞相比较E-cadherin表达无变化；过表达细胞株中Vimentin,Claudin-1表达降低,Notch-1信号通路蛋白的表达明显降低。2.细胞36小时的细胞迁移率依次为：DU145-TxR,68.8±2.86%: DU145-TxR-control,66.6±2.88%; DU145-TxR-E-cadherin,38.3± 1.63%; DU145-TxR细胞的迁移能力强于E-cadherin过表达细胞DU145-TxR-E-cadherin (P<0.01)。Transwell实验显示和亲本耐药细胞相比较E-cadherin过表达细胞24小时的侵袭和迁移能力都明显降低(P<0.01);MTS结果显示72小时IC50依次为PC3-TxR,146.81±1.46 nmol/L;PC3-TxR-control,139.13±4.60nml/L;PC3-TxR-E-cadherin, 96.2±15.03nmol/L;DU145-TxR, 3831.9±65.69nmlo/L;DU145-TxR-control, 3725.45±87.36nmol/L;DU145-TxR-E-cadherin,3022.10± 34.01 nmol/L。在两种不同的E-cadherin过表达前列腺肿瘤耐药细胞中,对紫杉醇的敏感性均强于其亲本耐药细胞(P<0.05)。3.和亲本细胞相比较PC3-si-E-cadherin,DU145-si-E-cadherin 中 E-cadherin表达降低,同时PC3-si-control,DU145-si-control和亲本细胞相比较E-cadherin表达无变化；PC3-si-E-cadherin,DU145-si-E-cadherin细胞中Vimentin, Snail表达升高,Notch-1信号通路的表达升高。4.细胞48小时的细胞迁移率依次为：DU145,56.5±1.4%;DU145-si-control, 58.2±2.36%; DU145-si-E-cadherin,85.1±2.90%; E-cadherin沉默细胞DU145-si-E-cadherin迁移能力强于DU145细胞的(P<0.01)。PC3细胞的克隆形成能力强于E-cadherin沉默细胞PC3-si-E-cadherin(P<0.01)。 DU145细胞的克隆形成能力强于E-cadherin沉默细胞DU145-si-E-cadherin(P<0.01)。MTS结果显示72小时IC50依次为PC3,9.49±0.89nmol/L；PC3.nc,9.71±2.38nmol/L；PC3-si-E-cadherin,14.73 ±1.58nmol/L:E-cadherin沉默细胞PC3-si-E-cadherin对紫杉醇的敏感度降低(P<0.05).DUl45,8.31±1.24nmol/L；DU145-nc,8.77±2.40nmol/L； DU145-si-E-cadherin,17.03±1.54nmol/L:E.cadherin沉默细胞DU145-si-E-cadherin对紫杉醇的敏感度降低(P<0.01)。结论：E-cadherin和前列腺肿瘤耐药细胞的EMT发生密切相关,并影响前列腺肿瘤细胞及其耐药细胞的侵袭,转移以及克隆形成能力并且和紫杉醇耐药性密切相关。9.49±0.89nmol/L；PC3.nc,9.71±2.38nmol/L；PC3-si-E-cadherin,14.73 ±1.58nmol/L:E-cadherin沉默细胞PC3-si-E-cadherin对紫杉醇的敏感度降低(P<0.05).DUl45,8.31±1.24nmol/L；DU145-nc,8.77±2.40nmol/L； DU145-si-E-cadherin,17.03±1.54nmol/L:E.cadherin沉默细胞DU145-si-E-cadherin对紫杉醇的敏感度降低(P<0.01)。结论：E-cadherin和前列腺肿瘤耐药细胞的EMT发生密切相关,并影响前列腺肿瘤细胞及其耐药细胞的侵袭,转移以及克隆形成能力并且和紫杉醇耐药性密切相关。第三部分Notch-1信号通路在EMT所介导的前列腺癌耐药机制中的作用目的：研究Notch-1信号通路在前列腺肿瘤细胞和EMT之间的关系以及在耐药机制中的作用。方法：1.应用Real-time PCR检测在检测E-cadherin过表达的前列腺肿瘤耐药细胞株中Notch-1的表达,以及在E-cadherin沉默后的前列腺肿瘤细胞中的Notch-1的表达；2.应用Western-blot方法检测γ-分泌酶的特异性抑制剂(GSI)在不同浓度不同时间对前列腺肿瘤耐药细胞中Notch家族成员的抑制效率；3.MTS检测GSI和紫杉醇联合给药对前列腺肿瘤耐药细胞的紫杉醇耐受性是否有所恢复；结果：1.在E-cadherin过表达的前列腺肿瘤耐药细胞株中Notch-1表达下调在E-cadherin沉默后的前列腺肿瘤亲本细胞中Notch-1表达上调；2.GSI在20μmol/L,72小时的时候明显抑制PC3-TxR, DU145-TxR细胞中Notch-1的表达；20μmol/L,24小时的时候明显抑制PC3-TxR, DU145-TxR细胞中Notch-4的表达；3.紫杉醇和GSI(20μmol/L)联合给药72小时的IC50依次为：PC3-TxR+GSI=13.9±1.59nmol/L, DU145-TxR+GSI=838.0±134.4 nmol/L;而紫杉醇单独给药72小时IC50依次为：PC3-TxR=191.2± 11.9nmol/L, DU145-TxR=3957.8 ±100.8nmol/L,联合给药后耐药细胞对紫杉醇的敏感度明显升高(P<0.01)；结论：在前列腺肿瘤细胞的Notch-1的表达和EMT的发生密切相关；GSI可以抑制前列腺肿瘤耐药细胞株中的Notch-1的表达,并且Notch信号通路对前列腺肿瘤紫杉醇耐受可能有着重要的调节作用。