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多杀性巴氏杆菌是一种重要的革兰氏阴性病原菌,能感染包括禽、猪、牛、兔等在内的多种家养和野生动物,导致以呼吸道感染为主的多种疾病。多杀性巴氏杆菌血清型众多,按照荚膜抗原的不同可以被分为A、B、D、E、F五种血清型;按照脂多糖抗原的不同可以被分为16种血清型(1-16)。五种荚膜血清型和16种脂多糖血清型又被分别划分为五种荚膜基因型(A、B、D、E、F)和8种脂多糖基因型(L1-L8)。有研究表明,不同血清型的多杀性巴氏杆菌在感染宿主时表现出一定的“宿主偏好性”(host predilection)。然而,决定多杀性巴氏杆菌这种“宿主偏好性”的分子基础目前还完全不清楚。此外,决定多杀性巴氏杆菌系统发生学的具体因素依然还不清楚。 当前,多杀性巴氏杆菌的流行与感染依然是我国养猪业最严重的威胁之一,然而其所受到的重视和关注程度依然不足;由于国内开展的相关研究较少,现有的关于我国猪群中多杀性巴氏杆菌的流行数据较为欠缺,流行菌株的分子生物学特征如脂多糖基因型、MLST基因型以及毒力基因的分布尚不清楚。因此,本研究拟针对当前在我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌展开分子流行病学调查,选取一定数量的猪多沙性巴氏杆菌开展全基因组重测序,结合本实验室已经完成的牛源和禽源多杀性巴氏杆菌以及NCBI数据库中已经公布全基因组序列的不同宿主来源的多杀性巴氏杆菌开展比较基因组学分析,比较基因型差异,为解析多杀性巴氏杆菌“宿主偏好性”的分子生物学机制奠定基础。取得的主要结果如下: 1.当前在我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌的荚膜基因型、脂多糖基因型及MLST基因型分析 本研究从2013年12月-2017年12月4年间来源于我国各规模化猪场患有疑似呼吸系统疾病的猪的各组织样品中分离鉴定出多杀性巴氏杆菌262株;其中荚膜A型多杀性巴氏杆菌128株,荚膜D型多杀性巴氏杆菌112株,荚膜F型多杀性巴氏杆菌7株,“未定荚膜型”多杀性巴氏杆菌15株,所占百分比分别为48.85%、42.75%、2.67%、5.73%。 2.我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌的毒力基因分布 利用PCR方法对全部262株多杀性巴氏杆菌的23种毒力基因(ptfA、fimA、hsf-1、hsf-2、pfhA、tadD、toxA、exbB、exbD、tonB、hgbA、hgbB、Fur、tbpA、nanB、nanH、pmHAS、ompA、ompH、oma87、plpB、sodA、sodC)进行检测,结果显示部分毒力基因如ptfA、fimA、exbB、tonB、Fur、ompA、ompH、oma87、sodA、sodC等基因的检出率在90.00%以上,而toxA与tbpA的检出率低于10.00%,此外,部分毒力基因如hsf-1、pfhA、tadD、hgbA、hgbB、nanB、nanH、pmHAS的检出率在30.00%~80.00%之间;进一步分析发现部分毒力基因的分布表现出一定的“基因型偏好性”,其中tadD和pmHAS表现出“荚膜基因型偏好性”强于“脂多糖基因型偏好性”;而pfhA、hgbA和hgbB表现出“脂多糖基因型偏好性”强于“荚膜基因型偏好性”;toxA、hsf-1和nanB则表现出特定的“荚膜:脂多糖基因型偏好性”,toxA仅在基因D:L6型菌株中被检测到,hsf-1在D:L6型菌株中的检出率显著高于其在其它荚膜:脂多糖基因型菌株中的检出率,nanB在基因型A:L6型菌株中的检出率显著高于其在其它荚膜:脂多糖基因型菌株中的检出率。 3.猪荚膜F型多杀性巴氏杆菌HN07的致病性分析及全基因组重测序 为了研究猪源荚膜F型多杀性巴氏杆菌的致病性,选取代表菌株HN07分别感染小鼠、鸡、家兔及猪,评估其毒力。研究发现相同剂量的猪源荚膜F型多杀性巴氏杆菌HN07对小鼠的毒力强于猪源荚膜D型产毒多杀性巴氏杆菌HN06;而即便是在很高剂量(~109CFU)的情况下,HN07对鸡几乎没有毒力;低剂量(~105CFU)的HN07能使家兔发生严重的呼吸道感染和肺炎,并引起死亡;进一步发现高剂量(~1010CFU)的HN07感染猪能够导致死亡,使猪发生支气管肺炎、间质性肺炎以及出血性肺炎。 4.猪多杀性巴氏杆菌的全基因组重测序 从本研究所分离鉴定的猪多沙性巴氏杆菌中选取45株开展全基因组重测序,经Illumina Hiseq Xten平台重测序并利用SPAdes拼接组装后,得到18~66个Contigs,平均长度位于35.0~130.4bp之间,N50位于160.99~631.49bp之间,由这些Contigs组成的45株猪多杀性巴氏杆菌的全基因组草图序列大小位于2.22~2.50Mb之间,平均G+C含量位于40.04~40.67%之间。经过基因组注释后发现,45株猪多杀性巴氏杆菌全基因组含有2087~2391个基因,其中具有编码蛋白功能的基因数目为2027~2330,转移RNA(tRNA)编码基因的数目为46~53个,核糖体RNA(rRNA)的数目分别为7~10个。 5.不同宿主来源的多杀性巴氏杆菌的荚膜基因型、脂多糖基因型及MLST基因型分析 为了研究不同宿主来源不同基因型的多杀性巴氏杆菌在基因组水平上的差异同时筛选出可能与“宿主偏好性”有关的基因,我们从NCBI数据库中选取了62株分离自不同宿主的多杀性巴氏杆菌的全基因组列与本研究完成测序的45株猪多杀性巴氏杆菌的全基因组序列以及本实验室前期完成测序的2株猪多杀性巴氏杆菌HN04、HN05共109株多杀性巴氏杆菌的全基因组序列进行比较基因组学分析。109株不同宿主来源的多杀性巴氏杆菌包括16株禽源菌株、20株牛源菌株、56株猪源菌株和17株兔源菌株。 RIRDC MLST在16株禽多杀性巴氏杆菌界定出8种MLST基因型ST8、ST9、ST27、ST53、ST60、ST129、ST156和ST159,其中ST129所占比例最高(43.75%);20株牛多杀性巴氏杆菌包含4种MLST基因型ST65、ST79、ST80、ST122,其中ST122所占比例最高(60.00%);56株猪多杀性巴氏杆菌包含8种基因型ST7、ST9、ST13、ST27、ST50、ST74、ST122、ST287,其中ST50(即ST11,37.50%)、ST13(即ST3,23.21%)和ST74(即ST10,21.43%)所占比例较高;17株兔多杀性巴氏杆菌包括5种MLST基因型ST9、ST50、ST74、ST204、ST298,优势MLST基因型为ST9(52.94%)。 将荚膜基因型、脂多糖基因型、MLST基因型组合起来看,我们发现在禽多杀性巴氏杆菌的优势基因型为A:L1:ST129(43.75%);牛多杀性巴氏杆菌的优势基因型为B:L2:ST122(60.00%)和A:L3:ST79(30.00%);猪多杀性巴氏杆菌的优势基因型为D:L6:ST50(37.50%);兔多杀性巴氏杆菌的优势基因型为A:L3:ST9(52.94%)。 6.不同宿主来源的多杀性巴氏杆菌的比较基因组学分析 针对109株不同宿主来源的多杀性巴氏杆菌开展泛基因组分析,鉴定出了4256个基因簇,其中核心基因簇(Core gene clusters,存在于99%以上的菌株中)1806个,非核心基因簇(Dispensable gene clusters,存在于2株以上但是99%以下的菌株中)1841个,菌株特异性基因(Strain-specific gene,仅存在某一株菌株中)609个。 将所有的非核心基因簇的组成基因进行进一步的聚类分析。如果定义“宿主特异性基因”为某一基因仅存在于某一宿主来源的所有多杀性巴氏杆菌中但是不存在于其它宿主来源的所有菌株,没有筛选到“宿主特异性基因”;将筛选标准降低,定义“宿主特异性基因”为某个基因存在于某一宿主来源多杀性巴氏杆菌90%的菌株中并且在其它宿主来源的多杀性巴氏杆菌90%的菌株中都缺失,结果依然没有筛选到“宿主特异性基因”;将筛选标准进一步放低,定义“宿主特异性基因”为某个基因存在于某一宿主来源多杀性巴氏杆菌80%的菌株中并且在其它宿主来源的多杀性巴氏杆菌80%的菌株中都缺失,结果在牛源菌株、兔源菌株和禽源菌株中各筛选到一个基因,在猪源多杀性巴氏杆菌中筛选到5个基因。 将109株多杀性巴氏杆菌所编码的4256个基因簇提交到VFDB数据库进行注释,共鉴定出432个毒力基因。定义某一基因与某一基因组的BSR≥0.8认为该基因存在于该基因组中。按照这一标准,我们发现绝大多数毒力基因在在不同宿主来源的多杀性巴氏杆菌中的分布差异性不大,但是某些毒力基因表现出一定的“脂多糖:MLST基因型偏好性”。 7.多杀性巴氏杆菌的遗传进化分析 基于全基因组SNP及核心单拷贝基因SNP所构建的进化树发现109株不同宿主来源的多杀性巴氏杆菌按照同一脂多糖:MLST基因型被有效地聚类在一起。