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目的金属硫蛋白家族(metallothieonein,MT)富含巯基的低分子量(6kD)蛋白质,MT由61-62个氨基酸组成。MT家族可分为MT1、MT2、MT3和MT4四种异构体。MT1(包括MT1A、MT1B、MT1E、MT1G、MT1F、MT1X、MT1H 7个亚型)。MT有调节重金属(锌等)与蛋白结合,调节基因表达、细胞生长、清除自由基,解毒等作用。以往对MTlH的研究主要集中在其与一些重金属(如锌、镉、铜、银等)代谢方面的研究,但有关MT1H相互作用蛋白所知甚少,未见相关报道。有关MT与肿瘤间关系报道不一,提示其在不同肿瘤中作用也各不相同。MT1G在甲状腺乳头状肿瘤中表达下调,可能是甲状腺瘤的抑癌基因；在浸润性乳腺导管癌中MTⅠ和Ⅱ过表达；在消化道癌、睾丸生殖腺肿瘤、涎腺肿瘤、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、结直肠癌组织中观察到MT过表达,以上对MT在肿瘤学中的研究并没有对MT的各个亚型进行划分,可能MT各个的亚型在不同的肿瘤中发挥不同的作用。有一些报道认为致癌过程中MT的产生与致癌物质的刺激,癌基因激活有关。如：化学致癌物质乙基甲硝脲可激活体外培养的S49细胞MT的产生,那么肿瘤中尤其是肺癌中有哪样一些蛋白与其作用呢?我们利用酵母双杂交技术初步筛选出与MT1H作用的相关蛋白,并为进一步依据其相互作用蛋白研究其功能提供依据。材料和方法1、文库、菌株、质粒和试剂第三代Matchmaker Ga14双杂交系统(MATCHMAKER GAI4 yeast two hybrid system3, Clontech):BD克隆质粒pGBKT7,AD克隆质粒pGADT7,BD质粒阳性对照pGBKT7-T, BD质粒阴性对照pGBKT7-Lam。酵母菌株AH109、酵母培养基YPDA、人工合成营养缺陷型培养基(synthetic dropout minimal base, SD) SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade、X-a-半乳糖苷酶(X-a-gal)均购自Clontech公司。肺癌cDNA文库购自Clontech公司。大肠杆菌Topo10C为本教研室保存。所需的限制性内切酶,LA TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司。酸洗玻璃珠购自Sigma公司。2、实验方法(1)诱饵BD质粒pGBKT7-MT1H的构建及鉴定获得的人全长MT1H基因利用经PCR引入的NdeI/BamHI双酶切位点定向亚克隆至pGBKT7,转化大肠杆菌Topo10,卡那霉素筛选相应阳性克隆,双酶切提取的质粒鉴定插入片断大小,为BD质粒pGBKT7-MT1H,测序结果与GeneBankMT1H序列比较同源性。(2)酵母双杂交筛选①采用醋酸锂法将酵母双杂交系统中的重组诱饵载体pGBKT7-MT1H与肺癌cDNA文库质粒DNA共同转化至酵母菌株AH109,涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal平板上,30℃培养至菌落长出,筛选蓝色的阳性克隆。挑取所有单菌落的阳性克隆,在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal平板上反复传代3次,每次均以X-a-gal筛选,排除假阳性。②提取的大肠杆菌质粒DNA以pACT 5’、3’AD扩增引物PCR,产物经HaeⅢ酶切,琼脂糖凝胶电泳,去除重复的阳性克隆。对阳性质粒DNA测序分析鉴定。经GeneBank生物信息学分析确定基因。③回复杂交验证：将阳性克隆接种于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade液体培养基培养,玻璃珠法提取酵母。阳性克隆的质粒,转化至大肠杆菌Topol0C,卡那霉素筛选克隆,提取质粒DNA,与重组质粒pBGKT7-MT1H共同转化酵母菌株AH109,转化产物涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal,不能生长或生长菌落为白斑者作为假阳性排除。结果1、诱饵质粒pGBKT7-MT1H的构建及鉴定pGBKT7-MT1H经EcoRI/BamHI双酶切后,产生242bp左右大小DNA片段,与理论扩增大小一致。测序结果表明融合区域的读码框正确并有正确的方向。经测序证实为人MTlH序列且无碱基突变。2、诱饵质粒pGBKT7-MT1H的毒性及自激活效应检测将直径相同的AH109 (pGBKT7-MT1H)和AH 109 (pGBKT7)分别在3ml的YPDA液体培养基过夜培养后,600nm的吸光度分别为1.20和1.22,表明构建的诱饵质粒对酵母没有毒性,不能影响酵母正常生长。AH109 (pGBKT7-MT1H)在SD/-Trp/X-α-gal生长出白色菌落,在SD/-His/-Trp/X-α-gal不生长,排除了pGBKT7-MT1H激活自身报告基因的能力。3、基因序列的测定与分析(1)阳性克隆的分类在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-agal平板上筛选蓝色的阳性克隆。将排除假阳性后的质粒用HaeⅢ内切酶进行酶切,以10g/L琼脂糖凝胶电泳,可以看到不同大小的cDNA片段,根据片段大小共分11类。(2)序列测定结果根据上述片段大小分类结果,我们共筛选出8种相关蛋白。结论1、筛选出8种与MT1H相互作用的蛋白。