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目的:(1)观察灵芪胶囊含药血清对人肺腺癌细胞A549的增殖抑制作用。(2)观察灵芪胶囊含药血清对人肺腺癌细胞A549细胞凋亡诱导作用及凋亡相关基因(Bcl-2、C-myc、Bax、Survivin)表达的影响。(3)观察灵芪胶囊含药血清对人肺腺癌细胞A549细胞形态学及细胞周期的影响。(4)观察灵芪胶囊对Lewis肺癌荷瘤小鼠转移瘤及肺转移灶的抑制作用。(5)初步探讨灵芪胶囊抑制肺癌血管生成作用及其对相关血管生成因子表达的影响。方法:(1)以人肺腺癌细胞系A549为实验对象,应用MTT法检测细胞对灵芪胶囊含药血清的敏感性及细胞生长曲线。(2)应用倒置显微镜及Wright-Giemsa法观察不同剂量的灵芪胶囊含药血清作用A549细胞在不同时间的形态改变,流式细胞仪检测其细胞周期,AnnexinV/PI双染法观察灵芪胶囊含药血清诱导细胞凋亡。(3)采用RT-PCR检测灵芪胶囊含药血清对人肺腺癌细胞A549细胞相关基因(Bcl-2,bax,C-myc,survivin)表达的影响。(4)建立Lewis肺癌荷瘤小鼠转移瘤模型,检测灵芪胶囊对转移瘤和肺转移灶的抑制率。(5)应用S-P免疫组织化学方法,检测灵芪胶囊对荷瘤小鼠血管生成因子(MMP-2、MMP-9、bFGF、COX-2)的表达情况。用分光光度计测量灵芪胶囊对荷瘤小鼠血清中iNOS含量的影响。(6)应用透射电镜和光镜观察转移瘤的形态学改变。结果:(1)灵芪胶囊含药血清对人肺腺癌细胞A549具有明显的生长抑制作用,并且在24-72h内存在剂量.时间依赖关系。与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05,0.01)。灵芪胶囊含药血清对细胞作用的最佳时间为72h,其抑制率达34.07%。灵芪胶囊含药血清对细胞作用96h时,其抑制率明显降低。(2)灵芪胶囊含药血清作用于A549细胞24h和48h时,部分细胞形态变圆,体积变小,细胞变成不规则状,少部分细胞脱落。72h时观察细胞的数量大大减少,部分细胞有融合的现象,细胞肿胀、破裂、坏死明显。吉姆萨染色后,细胞染色加深,胞体缩小、变圆,核浓缩,呈紫黑色,部分细胞核不能清晰显现。(3)灵芪胶囊含药血清对A549细胞均具有显著的G0/G1期阻滞作用,有效地影响细胞周期G1/S调控点。灵芪胶囊含药血清对A549细胞具有明显的凋亡诱导作用,其通过下调Bcl-2、survivin基因表达,上调bax、C-myc基因表达而诱导细胞凋亡和分化,72h的凋亡率为32.85%,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),并在180~200bp呈现经典的DNA梯状带。(4)灵芪胶囊对Lewis肺癌荷瘤小鼠表现出明显抑瘤作用,其抑瘤率分别为35.64%、29.23%、21.03%,并与复方环磷酰胺合用有明显的增效减毒作用。同时,灵芪胶囊有效的抑制肺癌转移,能够下调血管生长因子(bFGF、COX-2、MMP-9)的表达并降低血清中的iNOS含量而抑制肺癌血管生成,从而发挥抗转移作用。结论:(1)灵芪胶囊能够显著抑制肺腺癌细胞A549细胞的增殖,具有明显的生长抑制作用,并在一定时间内具有时间-剂量依赖性。(2)灵芪胶囊影响细胞周期,具有明显的G1/G0期阻滞作用,有效地影响细胞周期G1/S调控点从而抑制A549细胞的DNA合成和复制。同时通过影响凋亡相关基因表达而表现出显著的凋亡诱导作用。(3)灵芪胶囊对Lewis肺癌荷瘤小鼠表现出明显抑制作用,能够有效的抑制肿瘤生长。(4)灵芪胶囊有效的抑制肺癌转移,通过影响血管生长因子的表达,抑制肺癌血管生成而发挥抗转移作用。