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目的探索地衣芽孢杆菌BL63516对不同方式诱导的肠黏膜屏障功能受损模型的调节作用并探索其相关的肠道菌群调节机制,为临床疾病的治疗提供新思路。第一部分地衣芽孢杆菌BL63516对抗生素诱导的小鼠肠屏障功能受损模型的调节作用1.材料与方法30只健康SPF级雄性BALB/c小鼠(20±2 g)随机分为正常对照组(CON组),模型组(CS组),地衣芽孢杆菌干预组(BL组),每组10只。前8日给予CON组小鼠生理盐水0.2 ml灌胃,1天2次。其余2组小鼠给予300 mg/ml头孢曲松钠0.2 ml,1天2次灌服以建立肠道菌群紊乱及屏障功能受损模型。第9天起CON组和CS组小鼠每天给予生理盐水0.2 ml灌胃,BL组小鼠3×10~7CFU/ml地衣芽孢杆菌0.2 ml灌胃,连续8日。期间观察记录小鼠体重,评估其精神活动状态、毛发色泽、粪便性状,留取粪便。使用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测小鼠血清及肝脏组织中脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)水平,结肠组织HE染色检测结肠炎症浸润水平,PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)方法及16S rRNA高通量测序分析小鼠肠道菌群结构。2.结果抗生素诱导小鼠肠道菌群紊乱并造成了肠黏膜屏障功能受损,与CON组比,CS组的肠黏膜损炎性浸润严重,血清LPS水平显著升高,CS组较CON组菌群丰度及多样性显著降低,拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、疣微菌门细菌显著减少,厚壁菌门成为优势菌。地衣芽孢杆菌干预显著降低肠屏障通透性,保护肠黏膜屏障功能,改善肠道菌群紊乱,与CS组比,BL组肠黏膜的炎症浸润缓解,血清LPS水平显著降低,菌群丰度及多样性显著升高,阿克曼氏菌属丰度显其著下降,乳酸菌属丰度显著升高。3.结论本实验结果提示地衣芽孢杆菌BL63516可以通过调节肠道菌群有效改善抗生素所致的肠屏障功能损伤和肠道菌群紊乱。第二部分地衣芽孢杆菌BL63516对结肠炎小鼠肠屏障功能的调节作用1.材料与方法将30只健康SPF级雌性BALB/c小鼠(20±2 g)分为正常对照组(CON组),炎症性肠病模型组(DSS组),地衣芽孢杆菌干预组(BL组),每组10只。CON组给予正常饮食饮水,DSS组及BL组小鼠以3%(m/v)葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium salt,DSS)作为唯一饮用水,自由饮用,连续7天,建立炎症性肠病模型。同时,自第1天起,给予BL组小鼠3×10~7 CFU/ml地衣芽孢杆菌溶液0.2 ml灌胃,其余2组给予生理盐水0.2 ml灌胃,连续7天。每日记录其体重、精神活动状态、毛发色泽、粪便性状。第8天处死小鼠,取血清,结肠组织及肠内容物备用。ELISA法检测小鼠血清和结肠研磨液中的LPS及细胞因子水平,肠组织HE染色检测结肠病理学改变,免疫印迹法检测紧密连接蛋白occludin表达水平,PCR-DGGE及16S rRNA高通量测序分析小鼠肠道菌群结构。2.结果DSS成功诱导了小鼠结肠炎,破坏了小鼠肠黏膜屏障功能,显著改变了肠道菌群物种丰度和菌群结构。与CON组比,DSS组的结肠疾病活动指数升高,结肠病理评分显著升高,血清MPO水平显著升高,肠紧密连接蛋白表达水平显著降低,菌群丰度显著降低,拟杆菌门丰度显著升高。BL组与DSS组相比,疾病活动活动指数及结肠病理评分显著降低,提示结肠炎症状缓解;肠黏膜炎症浸润减轻,血清IL-10水平显著升高,血清LPS水平显著降低,肠紧密连接蛋白表达水平显著升高,表示地衣芽孢杆菌的干预保护了小鼠的肠道免疫功能和黏膜屏障功能;BL组小鼠肠道菌群丰富度显著升高,菌群结构较DSS组发生改变,其中疣微菌门丰度增加,拟杆菌门丰度降低,肠道菌群紊乱得到了缓解。3.结论地衣芽孢杆菌可以有效改善DSS诱导的黏膜屏障功能受损的症状,其作用机制与肠屏障功能和肠道菌群的调节有密切关系。第三部分地衣芽孢杆菌BL63516对高脂血症大鼠肠屏障功能的调节作用1.材料与方法将18只健康SPF级雄性SD大鼠(400±20 g)随机分为对照组(CON),高脂饮食组(HF),地衣芽孢杆菌干预组(BL),每组6只。正常组给予普通饮食,HF组,BL组均给予高脂饮食,同时从第1日给予BL组大鼠7.5×10~8CFU/ml地衣芽孢杆菌0.4 ml灌胃,CON和HF组给予生理盐水0.4 ml灌胃,连续21日。期间记录其体重,饮食饮水量,粪便性状。第22日处死大鼠,内脏脂肪称重,留取血清,结肠组织及肝脏组织。酶法检测血脂水平,ELISA法检测小鼠血清和肝脏研磨液中的LPS水平。免疫印迹检测紧密连接蛋白表达水平,PCR-DGGE方法及16S rRNA高通量测序分析小鼠肠道菌群结构。2.结果高脂饮食大鼠出现高脂血症,肠道菌群紊乱。与CON组比,HF组的体重快速增长,Lee’s指数,内脏脂肪比重显著升高,血清T-CHO,TC,LDL-C水平显著升高,肠道菌群丰度显著降低。地衣芽孢杆菌的干预显著减轻大鼠的肥胖程度和高脂血症水平,增强肠屏障功能,调节肠道菌群。与HF组比,BL组Lee’s指数,内脏脂肪比重显著降低,血清TC,LDL-C水平显著降低,肠紧密连接蛋白occludin表达水平升高,血清LPS与肝脏LPS水平显著降低,肠道菌群结构改善,其中,Parabacteroides水平显著升高,Desulfovibrionaceae水平显著降低。3.结论地衣芽孢杆菌对高脂血症大鼠的血脂异常有改善作用,通过调节菌群结构保护了肠黏膜屏障的功能。