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背景：梓葛冻干粉针是依据古方和现代药理学研究,自主研发的中药单体复方新药,已申请国家发明专利,主要由梓醇和葛根素配伍而成,用于治疗脑缺血及其后遗症。前期药理学实验表明：梓葛冻干粉针能提高脑神经血管单元的耐缺氧能力、保护神经元；抑制氯化钴诱导的PC12细胞凋亡；改善局限性永久性脑缺血大鼠脑血流,减轻脑水肿等作用。本课题获得了重庆市科技攻关计划项目(No.CSTC,2010AC5011);重庆市卫生局中医药科技项目(No.2010-2-148)的支持。目的：研究梓葛冻干粉针在正常大鼠以及脑缺血模型大鼠的药代动力学,考察梓葛冻干粉针在大鼠肝肾分布,探讨梓葛冻干粉针对脑缺血模型大鼠血脑屏障通透性的改善作用及其机理,旨在阐明梓葛冻干粉针的药代动力学规律,并为其新药创制提供依据。方法与结果：1.梓葛冻干粉针在正常大鼠血浆和脑脊液中的药代动力学研究建立了HPLC-APCI-MS/MS方法测定大鼠血浆和脑脊液中梓醇的含量,HPLC-ESI-MS/MS方法测定大鼠血浆和脑脊液中葛根素的含量。梓醇的测定采用桃叶珊瑚苷为内标,流动相为甲醇：20mM醋酸铵水溶液(V/V,50：50),葛根素测定采用染料木素为内标,流动相为0.1%甲酸甲醇：10mM醋酸铵水溶液(V/V,80：20),流速0.6mL·min-1。运用Agilent6410三重四级杆串联质谱的多反应监测(MRM)模式检测,并进行了方法学验证。结果显示,在各生物样品浓度范围内,均呈良好线性(r>0.990),大鼠血浆、脑脊液中梓醇的最低定量限分别为10ng·mL-1、20ng·mL-1,葛根素的最低定量限均为20ng·mL-1,高、中、低浓度质控样品的日内、同间精密度<15%,日内、日间准确度均在±15%范围内,待测物和内标的提取回收率基本一致,说明所建立的方法灵敏,准确、可靠,符合生物样品分析测定的要求。应用建立的方法,测定尾静脉注射梓醇冻干粉针、葛根素冻干粉针和梓葛冻干粉针后,大鼠血浆和脑脊液中梓醇和葛根素的含量,数据经药动学软件DAS2.1处理,获得了梓醇和葛根素的血浆和脑脊液药代动力学参数。结果表明,在梓葛冻干粉针组,梓醇的血浆和脑脊液达峰浓度(Cmax)分别为23024.4ng·mL-1和415.5ng·mL-1,半衰期(t1/2)为0.369h和1.022h,药时曲线下面积(AUC(o～5h))为10732.5ng·h·mL-1和395.4ng·h·mL-1,平均滞留时间(MRT(0-∞)为0.437h和1.357h；血浆和脑脊液中葛根素的Cmax分别为56529.4ng·mL-1和899.6ng·mL-1,t1/2为0.311h和0.537h,AUC(0～5h)为17136.3ng·h·mL-1和449.6ng·h·mL-1, MRT(0-∞)为0.273h和0.640h；梓醇和葛根素在脑脊液中的Tmax分别为0.050h和0.080h,梓醇的AUC脑脊液/AUC血浆为4.14%,葛根素的AUC脑脊液/AUC血浆为2.77%。以上数据说明,梓葛冻干粉针的药物成分均可透过正常大鼠血脑屏障,且达峰迅速,这将为确定梓葛冻干粉针的临床用药方案提供实验依据。2.梓葛冻干粉针在脑缺血大鼠血浆和脑脊液中的药代动力学研究运用以上建立的HPLC-APCI-MS/MS和HPLC-ESI-MS/MS方法对脑缺血模型大鼠体内梓葛冻干粉针的药代动力学进行了研究。结果表明,梓醇的血浆和脑脊液Cmax分别为17523.2ng·mL-1和592.2ng·mL-1, t1/2为0.455h和0.860h, AUC(0～5h)为7165.1ng·h·mL-1和516.3ng·h·mL-1, MRT(0-∞)为0.451h和1.110h；血浆和脑脊液中葛根素的Cmax分别为632430ng·mL-1和1812.2ng·mL-1, t1/2为0.755h和0.593h, AUC(0～5h)为20059.8ng·h·mL-1和1011.0ng·h·mL-1, MRT(0-∞)为0.273h和0.383h；梓醇和葛根素在脑脊液中的Tmax分别为0.083h和0.050h,梓醇的AUC脑脊液/AUC血浆为8.22%,葛根素的AUC脑脊液/AUC血浆为6.96%。说明梓葛冻干粉针能透过脑缺血模型大鼠血脑屏障,且达峰迅速,有利于梓葛冻干粉针发挥治疗作用。3.梓葛冻干粉针在脑缺血模型大鼠与正常大鼠的药代动力学比较运用单因素方差分析(one-way ANOVA)的LSD-t检验进行组间比较,分析结果表明,模型大鼠血浆中梓醇的Cmax和AUC(0～5h)较正常组显著降低(P<0.05),脑脊液中梓醇的Cmax较正常组显著升高(P<0.05)；模型大鼠血浆中葛根素的t1/2较正常组显著延长(P<0.05),脑脊液中葛根素的Cmax和AUC(0～5h)较正常组显著升高(P<0.05)；与正常大鼠相比,梓醇和葛根素在脑缺血模型大鼠的AUC脑脊液/AUC血浆值均显著性升高(P<0.05)；其它药代动力学参数无显著差异(P>0.05)。说明在脑缺血病理状态下,脑脊液中梓醇的达峰浓度显著升高(P<0.05),葛根素的达峰浓度和总循环量显著升高(P<0.05),梓醇与葛根素的血脑屏障透过率均显著升高(P<0.05),这都有利于梓葛冻干粉针治疗脑缺血及其后遗症。4.梓葛冻干粉针在大鼠肝肾组织的分布建立了测定大鼠肝肾组织中葛根素含量的HPLC-UV方法,最低定量限为0.375μg·mL-1,标准曲线范围内线性关系良好(r>0.999),高、中、低3个浓度下测得日内和日间精密度RSD均低于15%,满足生物样品分析测定的要求。采用所建立的方法,对尾静脉注射葛根素冻干粉针和梓葛冻干粉针后大鼠肝肾中葛根素的分布进行了比较研究。结果表明,两种制剂中葛根素在肾脏的Tmax一致,均为10min,MRT(0-∞)也基本一致,约为0.5h；与葛根素冻干粉针组相比,梓葛冻干粉针组肾脏中葛根素Cmax值显著性降低(P<0.05),仅为前者的81.54%,AUC(o～2h)值也显著性降低(P<0.05),仅为前者的74.46%。说明梓葛冻干粉针组中葛根素的肾脏分布较葛根素冻干粉针组显著降低(P<0.05)。在肝脏组织中,梓葛冻干粉针组和葛根素冻干粉针组的Cmax值分别为20.9μg·g-1、23.8μg·g-1, AUC(0～2h)值分别为9.5μg·h·g-1、10.1μg·h·g-1, MRT(0-∞)值分别为1.746h、1.455h,两组间比较无显著性差异(P>0.05)。说明葛根素与梓醇配伍后,对葛根素的肝脏分布和消除无明显影响。以上研究结果从药代动力学方面证明,梓醇可降低葛根素在肾脏中的分布,梓葛冻干粉针的肾脏安全性可能更高。5.梓葛冻干粉针对血脑屏障通透性的影响及其机制初步研究了梓葛冻干粉针对血脑屏障通透性的影响及其机制。开颅法制备脑缺血模型,设正常组、模型组和药物组,模型组与药物组分别设1d、3d、7d三个小组,药物组静脉给与梓葛冻干粉针(32.7mg/kg),模型组给予等体积生理盐水。分别于连续给药1、3、7d后,紫外分光光度法测定大鼠脑组织中伊文思蓝的含量,考察梓葛冻干粉针对血脑屏障通透性的影响；通过免疫荧光和免疫印迹技术初步考察梓葛冻干粉针对脑微血管紧密连接相关蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1的分布和表达的影响。结果表明,在连续给药7d后,模型组与药物组脑组织中伊文思蓝的含量分别为2.06μg·g-1和0.97μg·g-1,与模型组相比,梓葛冻干粉针能显著降低脑缺血模型大鼠脑组织中伊文思蓝含量(P<0.05),说明梓葛冻干粉针改善了模型大鼠的血脑屏障通透性。免疫荧光结果显示,与正常组相比,模型组脑血管周围的Claudin-5.Occludin、ZO-1分布不连续,且随时间延长,逐渐减少；与模型组相比,随给药时间延长,药物组脑血管周围Claudin-5、Occludin、ZO-1的分布逐渐连续,丰富。Western blot的检测结果表明,与正常组相比,在第3d、7d,模型组的Claudin-5、Occludin、ZO-1表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比,在第3d和7d时,药物组的Claudin-5表达水平显著升高(P<0.05),在第3d时,药物组的Occludin表达水平显著升高(P<0.05),在第7d时,药物组的ZO-1表达水平显著升高(P<0.05)。以上结果提示,梓葛冻干粉针降低脑缺血模型大鼠血脑屏障通透性的机制可能与增加脑微血管中紧密连接相关蛋白Claudin-5、Occludin、 ZO-1的分布和表达有关。结论：1.研究获得了梓葛冻干粉针在血浆和脑脊液中的药代动力学参数,为确定梓葛冻干粉针的临床用药方案提供了参考依据。2.梓葛冻干粉针的药物成分梓醇和葛根素在脑缺血模型大鼠脑脊液中的分布量显著高于正常组,显示梓葛冻干粉针用于治疗脑缺血易于透过血脑屏障,制剂合理。3.梓葛冻干粉针中葛根素在肾脏的分布量显著低于单纯葛根素冻干粉针,说明与梓醇配伍后,梓醇降低了葛根素在肾脏的分布,梓葛冻干粉针对肾脏的安全性高于单纯葛根素制剂。4.梓葛冻干粉针能显著降低脑缺血时血脑屏障通透性,其机理可能与梓葛冻干粉针能增加微血管中紧密连接相关蛋白Occludin、ZO-1、Claudin的分布和表达有关。