弓形虫是一种危害严重的人兽共患病原,可感染温血动物的有核细胞。弓形虫感染在免疫能力正常的人群中通常无明显症状,妊娠期动物或人感染会导致流产、死胎或胎儿严重的先天性缺陷,例如失明、智力低下和脑积水等。弓形虫具有多种形态和复杂的生活史,需要依赖转录后调控、翻译后修饰（PTMs）和蛋白质降解等过程维持上述生命活动。其中,弓形虫中已经发现的PTMs包括磷酸化、乙酰化、琥珀酰化、棕榈酰化、泛素化等。类泛素分子URM1首次在酵母中被鉴定,可与多种靶蛋白共价偶联,进而发挥不同的功能,涉及酵母高温出芽生长及氮代谢等过程。利用URM1保守结构域,在Toxo DB数据库比对后发现弓形虫可能存在Tg URM1类泛素蛋白。生物信息学分析结果显示其具有类泛素家族的典型特征,包含β-折叠和保守的C-末端双甘氨酸（GG）基序。本研究拟以弓形虫为模式生物对Tg URM1功能及作用机制进行初步探讨和研究,为顶复门其他原虫的代谢调控研究提供新的思路。通过CRISPR/Cas9技术构建Tg URM1内源性标记虫株,发现该蛋白定位于弓形虫速殖子的胞质中。为进一步研究其在弓形虫中的作用,利用CRISPR/Cas9技术构建了Tg URM1基因敲除虫株ΔURM1。ΔURM1虫株表现为生长缓慢,其入侵细胞、胞内增殖能力均显著下降,这表明Tg URM1可能在弓形虫生长过程中发挥重要作用。运动能力是影响弓形虫入侵的一个重要因素,敲除Tg URM1后的弓形虫无法完成经典的螺旋和转圈运动,仅表现为短距离滑移,表明ΔURM1虫株存在运动缺陷,影响其入侵过程。对于ΔURM1虫株增殖能力显著降低的原因推测是Tg URM1参与调控虫体分裂。以胞核分裂标志蛋白顶质体酰基载体蛋白ACP和胞质分裂标志蛋白内膜复合体蛋白IMC1为参照对象,明确敲除Tg URM1对弓形虫分裂的影响,结果表明二者在定位和形态上并无显著异常,说明Tg URM1的缺失并未导致弓形虫分裂异常,其增殖能力下降原因还需进一步探索。此外,ΔURM1虫株还表现为对小鼠致病力降低,腹腔感染ΔURM1虫株速殖子的小鼠死亡时间延长甚至出现未死亡现象。成囊实验和免疫逃避相关基因转录水平检测结果表明,ΔURM1虫株不易被诱导成囊,且免疫逃避相关基因转录水平显著下降,说明ΔURM1虫株对小鼠致病力下降可能是由于其更易被小鼠免疫系统所识别并清除。综上表明,Tg URM1参与并影响了弓形虫的生长发育。一般认为,类泛素蛋白可通过与底物蛋白质结合的方式,调控底物蛋白的功能。因此,我们需要进一步明确Tg URM1是否也可以与底物蛋白质结合。构建Tg URM1真核质粒并将其转染HEK293T细胞,Western Blot结果未有明显偶联蛋白的存在。鉴于URM1具有多种功能,猜测它与底物蛋白的结合为一种应激依赖性过程。所以将转染Tg URM1基因的HEK293T细胞置于多种应激刺激环境中,结果显示氧化剂刺激条件下Tg URM1会与多个靶蛋白偶联现象,诱导Tg URM1类泛素化。随后,将Tg URM1内源性标记虫株置于多种氧化剂环境,结果显示弓形虫中在不同氧化剂刺激条件下Tg URM1也会与底物蛋白产生多个偶联条带,这表明氧化剂会诱导Tg URM1体内类泛素化。随后,为明确Tg URM1的C-末端双甘氨酸基序是否是类泛素化的关键结合位点,将缺失C-末端GG基序的Tg URM1转染HEK293T细胞,结果显示,同样在氧化剂刺激条件下,缺失C-末端GG基序的Tg URM1无法形成明显的偶联条带,表明缺失会阻断URM1类泛素化。为探究氧化剂诱导下与Tg URM1偶联的靶蛋白,利用蛋白质组学和生物素临近标记技术对Tg URM1的靶蛋白进行筛选。质谱鉴定结果显示,在Dia存在的情况下,生物素邻近标记法鉴定出51个蛋白质。结合蛋白质组学筛选到的107个蛋白质,共有22个共同蛋白被鉴定。这些蛋白质大多参与调节氧化应激反应、免疫逃逸和脂类代谢。基于质谱结果和本实验室前期研究,选取Tg AHP1作为Tg URM1调控弓形虫氧化应激反应的靶蛋白并进行验证。免疫共沉淀显示二者仅在氧化剂Dia刺激条件下可以发生互作,表明Tg URM1在弓形虫抗氧化应激过程中发挥重要作用。为验证Tg URM1是否参与弓形虫抗氧化应激反应,选取Dia和t BOOH作为氧化剂,模拟氧化应激环境。Dia是诱导Tg URM1与靶蛋白共轭的重要氧化剂,而t BOOH是弓形虫半胱氨酸依赖性过氧化物酶体蛋白AHP1的敏感底物。结果显示缺失Tg URM1的弓形虫对氧化应激耐受性降低,具体表现为在氧化应激条件下入侵增殖及小鼠致病力较原始虫株更为大幅度下降,这表明Tg URM1参与弓形虫抗氧化应激过程。随后对弓形虫体内的ROS水平进行检测,结果显示与其他虫株相比,Dia和t BOOH会引起Tg URM1缺失虫株体内活性氧的大幅度增加。表明体内ROS的积累可能是Tg URM1缺失虫株氧化应激条件下致病性和生存力下降的主要原因。综上所述,弓形虫存在Tg URM1类泛素系统,该系统调控弓形虫的生长和抗氧化应激反应;Tg URM1的完全缺失导致了弓形虫入侵、增殖和小鼠毒性的显著降低;氧化剂显著诱导Tg URM1类泛素化过程,且Tg URM1 C-末端双甘氨酸基序在类泛素化过程中发挥重要作用;Tg URM1通过Tg AHP1调控弓形虫抗氧化应激反应。