论文部分内容阅读
乙型肝炎病毒感染是一个全球性的公共卫生问题,慢性乙型肝炎常常发展为肝硬化、肝癌甚至肝衰竭。肝细胞肝癌(HCC)患者中乙型肝炎病毒(HBV)感染率高达50%～80%,其中HBX蛋白在HBV致癌过程中发挥了重要作用。目前治疗HBV感染主要采用干扰素及核酸类似物,但存在副作用大、病毒变异逃逸等问题,因此,新的治疗手段和新药开发具有重要意义。RNA干扰(RNA interference,RNAi)作为一种转录后基因沉默手段已经在肿瘤、慢性疾病及感染性疾病的治疗中显示出巨大潜力及应用前景;目前认为siRNA临床应用中最主要的瓶颈在于其稳定性较低并缺乏有效的靶向转运策略。常用于转运siRNA的系统主要有纳米载体(nanocarrier)和分子连接体(molecular conjugate)两类。分子连接体多采用靶向性配体及穿透性多肽策略。HBV表面蛋白包含大蛋白(L)、中蛋白(M)、小蛋白(S),三者均具有S结构域,M蛋白较S蛋白多出55个氨基酸的preS2区域,而最外面的L蛋白较M蛋白又多出108或119个氨基酸的preS1区域。HBV侵入肝细胞的过程尚未彻底清楚,其特异性受体尚无明确结论。但相关的研究均表明preS1可能是病毒与细胞膜上特异性受体结合并携带病毒基因组进入细胞内的配体;而preS1与受体结合的区域主要在其N端,其中21-47aa多肽片断被证实起关键性作用。目的:本实验旨在成功构建HepG2-HBX稳定表达株的基础上,验证preS1连接体特异转运siRNA进入细胞内进行RNA干扰的能力,为乙型肝炎病毒及肝癌的治疗及预防提供新的探索。而目前国内外尚无相关实验报道。方法:本课题以HBV病毒中的X基因为RNA干扰对象;用脂质体将含有HBX序列的真核表达质粒pCDNA3.1(+)/HBX-Flag转染入HepG2细胞系,通过G418筛选后分别经RT-PCR和免疫组化,对HBX的稳定表达进行验证;化学合成靶向HBX的siRNA(即siHBX),用脂质体转染进入HepG2-HBX细胞株,分别以RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测HBX mRNA表达水平变化,Western Blot检测HBX蛋白表达水平差异。在验证HBX稳定表达及siHBX有效性的基础上,化学合成pres1分子连接体,pres1分子连接体分别与肝细胞系与siRNA进行结合能力试验,然后以preS1分子连接体作为转运载体转染siHBX入HepG2-HBX后经实时荧光RT-PCR及Western Blot检测siHBX对HBX基因的抑制效果。结果:转染筛选试验结果显示HBX转染成功;进一步的RT-PCR和免疫组化结果提示19号阳性克隆高水平稳定表达HBX基因。siHBX作用HepG2-HBX细胞系后36h和72h后对HBX mRNA的抑制率分别为85.37%±3.02%和58.05%±4.00%,而非特异性对照siRNA对HBX mRNA的抑制率分别2.11%±0.04%和1.02%±0.05%;免疫印迹实验及细胞流式检测验显示siHBX能够抑制HBX蛋白及细胞周期进展。进一步凝胶电泳迁移试验(EMSA)证实preS1分子连接体能够与siRNA进行有效结合(摩尔比10:1),同时可以携带siRNA进入肝细胞内高效抑制HepG2-HBX细胞株内HBX的表达。与空白组相比,非特异阴性对照组抑制率为11.94±6.3%,而阳性对照组(脂质体)及实验组(preS1分子连接体)的抑制率分别为85.24±2.6%和77.80±6.10%。结论:上述结果显示本实验组成功构建了HepG2-HBX细胞株,同时证实了siHBX的有效性及特异性;preS1分子连接体可作为一种新型siRNA转运载体,携带siHBX进入肝癌细胞内发挥RNA干扰机制,为乙型肝炎病毒相关性肝脏疾病的治疗提供了新的途径。