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本文的研究分两部分：一、天花粉蛋白基因启动子及其转座子TKtcsw的调控功能研究；二、具有双重功能的TYchi基因的克隆与表达及其活性分析。
天花粉蛋白(TCS)来源于多年生栝楼的块根，具有rRN_AN-糖苷酶活性，属于Ⅰ型核糖体灭活蛋白(RIPs)。RIPs广泛分布于多种植物以及植物不同组织中。体外实验以及转基因实验表明，RIPs具有抗病毒、抗真菌和抗虫等活性，但是至今RIPs在植物体内的生理功能仍然不甚明确。我们从tcs基因的启动子入手研究它的表达调控，以了解TCS在栝楼体内的生理功能。
我们将从栝楼中克隆到的tcs基因启动子Tp9和Tp12连接GUS报告基因转入拟南芥。发现Tp9和Tp12在转基因拟南芥中都表现出受光照、病原菌、SA和蔗糖诱导的活性。这两个启动子的表达特性与tcs基因在栝楼中表现出的受诱导活性类似。特别在光/暗应答反应中，Tp9比Tp12表现出更高的的受光诱导的活性。对比这两个启动子的序列发现，在约-210上游都存在300bp左右的一个新的MITEs类转座子家族-TKtcsw的序列，而Tp9与Tp12序列的差异主要是由于Tp09中是两个转座子(TKtcswl和TKtcsw2)形成的嵌合结构而Tp12只有一个转座子(TKtcsw3，与TKtcsw1和TKtcsw2的相似性分别为79％和95％)。因此我们认为正是TKtcsw1的插入形成嵌合结构引起Tp9对光的敏感性增强。为了证实TKtcsw1转座子的作用，我们分别将Tp9上的TKtcsw1敲除，并嵌合到Tp12中，构建了pCTp9-TKtcsw1和pCTp12+TKtcsw1两种质粒，并将其转入拟南芥。转基因植株F1代GUS荧光活性分析显示，Tp9-TKtcsw1受光诱导能力比原Tp9降低了约2.3倍，而Tp12+TKtcsw1比Tp12提高了2.5倍。我们认为这一改变正是TKtcsw1从Tp9中敲除和嵌合到Tp12中造成的。为了进一步研究TKtcsw1转座子对启动子功能的影响是源于它的稳定的二级结构还是它携带的潜在光响应元件(IightresponsiveelementLRE)，我们针对Tp9上的TKtcsw1转座子的结构序列及其携带的潜在光响应元件进行了5’端缺失突变，并将其缺失启动子连接Gus基因转入拟南芥。对转基因植株F1代进行光/暗诱导，分析GUS荧光活性的结果显示：1)缺失了TKtcsw1的5’末端重复序列(TIR)等转座子结构序列导致启动子的活性及受光诱导的能力呈大幅下降趋势；2)缺失-773--705区域(缺失一个可能与下游GT1-box协同作用I-box)的启动子比缺失-796--774区域(缺失了TKtcsw1的5TTR)的启动子在暗处理条件下活性上升了25％;3)缺失-704--610区域(保留I-box、G-box等元件)的启动子比缺失-609--564区域(缺失了可能与下游G-box协同作用的I-box等元件)的启动子受光诱导活性高近200％。这些区域里包括了不同的潜在光响应元件及其不同组合，彼此可能以协同方式对光/暗响应，起到正或负调控的作用。以上研究结果表明：tcs基因受到包括病原菌在内多种因素的诱导调控，说明TCS在栝楼植物中可能参与了防御反应以及生长发育等多个过程；同时我们还发现在tcs基因启动子中的MITEs类转座子TKtcsw1可能携带了光响应元件，这些元件以协同作用的方式影响tcs基因窟动子的活性，说明MITEs类转座子及其携带的顺式作用元件在植物基因组的表达调控中发挥了重要作用。
几丁质酶也是植物中与抗病相关的重要蛋白之一，在抗真菌植物基因工程的研究中，几丁质酶及其基因的研究是目前最活跃的领域之一。我们通过TAIL-PCR的方法，从栝楼中克隆到一个新的几丁质酶Ⅲ(TYchi)基因及其部分上游序列。该基因全长为I169bp，编码区为209-1087，编码292个氨基酸的蛋白质。该蛋白的氨基酸序列与其它植物的几丁质酶Ⅲ序列相似性最高达71％。我们在TYchi蛋白一级结构的N-端发现了一个信号肽切割位点，并确定TYchi蛋白N端25个氨基酸为信号肽(MAAHKITTALSVIFLLAPIFQSSHA)。据此推测的成熟蛋白的分子量为28.247kDa，等电点9.025，是一个碱性蛋白。以TYchi基因编码区600bp片段为探针对栝楼基因组DNA的Southernblot杂交结果显示，TYchi基因在栝楼中至少含有4个拷贝，组成一个小的基因家族。在该基因的表达特性分析中发现，野生型栝楼植株中TYchi基因只在根中表达，在叶片和茎中则检测不到表达的产物；而且，TYchi基因的表达不受水、机械损伤和乙酰水杨酸(SA)的诱导，但受病原菌F.oxysporumf.sp.niveum的诱导。在大肠杆菌中表达并分离纯化TYchi，酶活性检测结果显示，原核表达的TYchi具有几丁质酶的活性，可以水解底物乙二醇几丁质。体外实验也证明TYchi对真菌F.oxysporum和Botrytiscinerea.具有抑制作用。更有趣的是，我们还检测到TYchi具有rRNAN-糖苷酶活性，经过TYchi处理的大鼠肝细胞核糖体在苯胺的作用下切割释放R-frangment。我们通过细胞毒性实验发现，TYchi能够抑制肿瘤细胞JAR和U937的生长，其IC50分别为54.5μg/ml和73.3μg/ml。TYchi对于肿瘤细胞的毒性可能是源于它的N-糖苷酶活性。根据模拟的TYchi三维结构并与Ⅰ型RIPs的TCS的三维结构对比，我们预测出TYchi可能的rRNAN-糖苷酶活性位点及活性中心的氨基酸残基(siteⅠ：Tyr50，Tyr284，Glu38，Lys278;siteⅡ：Tyr31，Tyr204，Glu152，His186)。上述研究表明，栝楼TYchi不仅是一个与植物防御反应相关的重要蛋白，同时也是一种具有几丁质酶和rRNAN-糖苷酶双重功能的蛋白，有关TYchi在植物防御反应中所扮演的多重角色及其作用机制将引起人们广泛的兴趣。