背景肝衰竭或终末期肝病患者易并发感染,导致组织损伤和器官功能衰竭。文献报道,肝硬化进展期患者中性粒细胞功能障碍,在既往细菌感染患者中尤为明显。急性肝衰竭患者中也观察到中性粒细胞功能障碍,且中性粒细胞功能指标吞噬功能和氧化爆发可预测肝衰竭严重程度和结局。中性粒细胞是外周血中含量最丰富的白细胞,是参与抗感染第一线的主要固有免疫细胞,可迅速在感染与炎症部位聚集,通过吞噬、脱颗粒和中性粒细胞外网(Neutrophil Extracellular Traps, NETs)三种机制杀伤病原微生物。NETosis是在某些特殊刺激下(如佛波酯(Phorbol Myristate Acetate, PMA)、某些细菌和真菌等)中性粒细胞发生的不同于经典细胞死亡方式(坏死或凋亡)的特殊死亡方式；中性粒细胞发生NETosis向胞外释放的以DNA-蛋白质复合物为主要成分的网状结构称为NETS。目前关于NETosis机制的大部分研究基于PMA诱导下烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide Phosphate, NADPH)氧化酶依赖途径的NETs形成,通过激活Raf-MEK-ERK信号通路,表现为自噬发生和超氧化物(Reactive Oxygen Species, ROS)生成,阻断两者其中之一将抑制NETosis而促进凋亡。NADPH氧化酶依赖途径NETosis的重要环节还包括中性粒细胞弹性蛋白酶核转位、组蛋白H3瓜氨酸化、钙离子内流和组蛋白Hl及H4降解。NETs通过其DNA骨架粘附固定病原微生物以限制感染蔓延,随后通过中性粒细胞自身或其他免疫效应分子和细胞杀伤病原微生物；同时NETs可降解部分免疫效应分子,限制炎症反应；此过程可造成上皮和内皮细胞损伤。此外,NETs可促进血栓形成和肿瘤转移等。临床出血事件发生和大多数促凝因子减少是慢性肝脏疾病(特别是终末期肝病)的典型临床特征,其中血小板数量明显减少尤为突出。血小板在血栓形成、组织重建、物质运输和免疫反应等过程发挥了重要作用。人类血小板表达Toll样受体(Toll-like Receptor, TLR) 1-9,其中细菌脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)与血小板表面TLR4结合后,激活血小板,血小板活化后释放多种生物活性物质,包括多种与吞噬及生物合成相关的蛋白、非蛋白小分子和多种水解酶；活化血小板还可通过促进抗原提呈细胞活化激活机体免疫反应,或与中性粒细胞结合诱导NETs形成。目的观察慢加急性肝衰竭患者在体中性粒细胞外网形成；观察慢加急性肝衰竭患者在体中性粒细胞外网形成的影响因素。方法根据中华医学会肝病学分会相关指南建议,将入组患者分为慢性肝炎组(Chronic Hepatitis B, CHB)、肝硬化组(Cirrhosis, CIR)和慢加急性肝衰竭组(Acute-on-chronic Liver Failure, ACLF)收集血常规、肝功能检查和凝血功能检查结果以及病人预后等相关临床资料,并用酶联免疫吸附(Enzyme-linked Immunosorbent, ELISA)试剂盒检测血浆标本NETs相关标志物髓过氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)和中性粒细胞弹性蛋白酶(Polymorphonuclear Elastase, PMNE)水平。对比不同肝病进程患者在体NETs形成程度以及离体中性粒细胞NETs形成能力的差异,评估血浆NETs相关标志物对患者预后的价值。根据文献报道,分别成功造模正常对照、慢性肝损伤和LPS诱导急性及慢加急性肝损伤小鼠模型,然后通过肝脏病理切片H&E染色、Fraser-Lendrum染色和免疫荧光染色,镜下观察内毒素血症中肝内NETs形成。流式细胞术检测慢乙肝和慢加急性肝衰竭两组患者静脉全血LPS刺激前后中性粒细胞-血小板结合体百分比和中性粒细胞-血小板结合体PAC-1阳性率。通过荧光定量和显微镜观察血清素(Serotonin,5-HT)对NADPH氧化酶依赖途径和非NADPH氧化酶依赖途径NETs形成的影响。对比慢乙肝和肝衰竭患者血浆5-HT含量以及二磷酸腺苷(Adenosine Diphosphate, ADP)刺激后5-HT释放量。分离不同肝病进程患者外周血中性粒细胞,加入PMA或依屋诺霉素刺激后通过荧光定量和镜下观察NETs的形成,观察不同肝病进程患者形成NETs能力的差异。通过激活或抑制5-HT受体(5-HT Receptor, HTR)判定参与此过程的受体。最后通过荧光定量、免疫印迹法和免疫荧光等实验技术观察5-HT对NETs形成重要环节的影响。结果一、慢加急性肝衰竭患者在体NETs形成循环系统中的游离MPO和PMNE可作为NETs形成相关标志物,通过比较慢乙肝、肝硬化和慢加急性肝衰竭三组患者血浆MPO和PMNE水平可评估不同肝病进程患者在体NETs形成差异,结果显示：慢加急性肝衰竭组患者血浆MPO水平(log10 ng/ml)和PMNE水平(log10 pg/ml)与慢乙肝组和肝硬化组患者间差异无显著性(MPO:CHB vs.ACLF:3.194[2.85-4.23] vs. 3.219[2.70-3.89], P=0.3800; CIR vs.ACLF:3.145[2.45-3.93] vs.3.219[2.70-3.89], P=0.6347。PMNE:CHB vs. ACLF:5.02[4.34-5.74] vs.5.029[4.44-6.16], P=0.7488; CIR vs.ACLF:4.921 [4.4-6.06] vs.5.029[4.44-6.16], P=0.0767).根据30天预后将入组患者分为生存组和死亡组,结果显示：生存组和死亡组两组患者血浆MPO水平(log10 ng/ml)比较差异无显著性(3.154[2.45-3.93]vs.3.245[2.71-3.89],P=0.2535),生存组血浆PMNE水平(log10 pg/ml)低于死亡组,比较无统计学意义(4.941[4.4-6.16]vs.5.044[4.58-5.61],P=0.0565)因此我们进一步将肝硬化和慢加急性肝衰竭两组患者(本文归类为终末期肝病)中谷丙转氨酶(Alanine Transaminase, ALT)≥200IU/L的患者(N=37)根据其30天预后分为生存组和死亡组,结果显示：生存组血浆PMNE水平(log10 pg/ml)低于死亡组(4.941[4.4-6.16]vs.5.044[4.58-5.61],P=0.0205),血浆PMNE水平对预测患者30天预后有一定的准确性(AUC=0.7243, P=0.0216)。此外,这部分患者血浆PMNE水平与总胆红素(Total Bilirubin, TBIL)存在正相关(Rs=0.3912,P=0.0167),与其他肝功能指标如ALT、天冬氨酸转氨酶(Aspartate Transaminase, AST)和白蛋白(Albumin, ALB)无明显相关性(P>0.05)；与凝血酶原时间(Prothrombin Time, PT, Rs=0.3707, P=0.0167)、凝血酶时间(Thrombin Time, TT, Rs=0.4002, P=0.0386)、凝血酶原标准化比率(Prothrombin Time International Standard Ratio, PT-INR, Rs=0.3718, P=0.0235)和活化部分凝血活酶时间(Actived Partial Thromboplastin Time, APTT, Rs=0.2715, P=0.0055)存在正相关,与凝血酶原活动度(Prothrombin Activity, PTA)负相关(Rs=-0.3312,P=0.0452),但与纤维蛋白原(Fibrinogen, FIB)无明显相关性(Rs=0.0145,P=0.8955)二、慢加急性肝衰竭患者在体中性粒细胞外网形成的影响因素目前较为公认的解释ACLF病理生理机制的理论是"PIRO"概念,其中感染为重要急性打击和加重因素之一。因此我们采用LPS腹腔注射模拟内毒素血症造成肝脏损伤,慢加急性肝损伤小鼠模型肝脏病理切片Fraser-Lendrum染色显示肝脏结构严重破坏,无法辨认血栓形成；但急性肝损伤肝脏冰冻切片PMNE免疫荧光染色,镜下观察到中性粒细胞在汇管区静脉腔内集聚成团。LPS活化血小板与中性粒细胞形成结合体,诱导NETs释放。此为感染造成机体NETs形成的重要途径之一。用LPS处理慢乙肝和慢加急性肝衰竭患者全血,流式细胞术检测两组患者中性粒细胞-血小板结合体百分比和中性粒细胞-血小板结合体PAC-1阳性率。两组患者在无LPS刺激下中性粒细胞-血小板结合体百分比(P=0.8426)和中性粒细胞-血小板结合体PAC-1阳性率比较无统计学意义(P=0.9730)。LPS刺激前后对比,两组患者中性粒细胞-血小板结合体百分比(CHB:5.334[4.34-7.35]%Neutrophils vs.11.81[5.8-20.3]%Neutrophils, P=0.0285；ACLF:5.66[3.63-11.58]%Neutrophils vs.13.1[4.51-23.1]% Neutrophils,P=0.0222)和中性粒细胞-血小板结合体PAC-1阳性率(CHB: 2.272[1.16-4.19]% Neu-Plt aggregates vs.5.574[1.84-10.2]% Neu-Plt aggregates, P=0.0266；ACLF:2.229[0.615-6.58]％Neu-plt aggregates vs 5.334[1.88-11.2]％ Neu-PIt aggregates,P=0.0292)均升高。活化血小板释放多种生物活性物质,其中血清素(5-HT)为血小板中含量最丰富的生物活性物质之一。加入100μM 5-HT可明显抑制PMA诱导下NADPH氧化酶依赖途径NETosis(P=0.0002),并呈浓度依赖性。5-HT不能抑制lonomycin诱导的非NADPH氧化酶依赖途径中性粒细胞死亡,但明显抑制Spread NETs形成。机体95%血清素储存于血小板中,因此接下来我们检测了慢乙肝(CHB)和慢加急性肝衰竭(ACLF)患者血浆和血小板5-HT水平。结果显示：慢乙肝患者血浆5-HT含量(ng/ml)高于慢加急性肝衰竭患者(330.9[128.8-546.7]vs.165.8[28.73-610.6],P=0.0289)(图4.17A)；ADP刺激后,慢乙肝患者血浆5-HT含量(ng/ml)增高(330.9[128.8-546.7]vs.389[160.6-546.7],P=0.0391),增高百分比差异无统计学意义(124.4[0.615-6.58]%Control vs.99.71[89.53-107.4]% Control,P=0.0718),慢加急性肝衰竭患者血浆5-HT含量(ng/ml)无增高(165.8[28.73-610.6] vs.156.2[30.84-546.7],P=0.5625).但加入PMA和Ionomycin刺激慢乙肝、肝硬化和慢加急性肝衰竭三组患者离体中性粒细胞,结果显示：在PMA刺激180分钟,慢加急性肝衰竭患者离体中性粒细胞死亡少于慢乙肝患者(144[100.4-178.9]%Control vs. 315[178-428]%Control,P=0.0043)；与肝硬化患者比较差异无显著性(144[100.4-178.9]%Control vs.271[131.1-620.4]%Control,P=0.1320)；镜下观察慢加急性肝衰竭患者离体中性粒细胞NETs形成减少。慢乙肝、肝硬化和慢加急性肝衰竭三组患者离体中性粒细胞在lonomycin诱导下NETS形成水平差异无显著性(CHB vs. ACLF:238.3[144-369.6]% Control vs.185[131.5-313]% Control, P=0.1797;CIR vs. ACLF:191.7[119.3-434]% Control vs.185[131.5-313]% Control, P=0.5714)。三、血清素对中性粒细胞外网形成的影响5-HT的作用受体5-HT受体(HTR)包括1-7型,通过激活或阻断不同HTR,我们发现抑制HTR2b (P=0.0108)或激活HTR2b (P=0.0177)可调节5-HT对NETs形成的影响,但无法检测到HTR2b mRNA的表达。5-HT抑制NADPH氧化酶依赖途径NETs形成重要环节中的ROS形成(60分钟：P=0.0054；120分钟：P<0.0001；180分钟：P<0.0001)和PMNE核转位,但无法抑制组蛋白H3瓜氨酸化和自噬发生。结果讨论一、慢加急性肝衰竭患者在体中性粒细胞外网形成肝衰竭患者体内存在的多种损伤相关分子模式(Damage Associated Molecular Patterns, DAMPs),可被机体识别为危险信号,刺激固有免疫反应活化,其中包括促进中性粒细胞在炎症部位聚集并形成NETs。理论上肝衰竭患者在体NETs形成应增加,但临床数据分析提示总体慢加急性肝衰竭患者NETs水平并不比慢性乙肝或肝硬化患者更高,而进展期慢加急性肝衰竭患者在体NETs形成较高,可能与入组慢加急性肝衰竭组中部分患者处于稳定期或恢复期,其自身抗炎反应的良性代偿性增强有关,此时患者在体NETs形成较低或无。二、慢加急性肝衰竭患者在体中性粒细胞外网形成的影响因素小鼠实验及文献报道支持肝损伤诱导肝内NETs形成,但慢加急性肝衰竭患者LPS刺激前后中性粒细胞-血小板结合体水平与对照组无显著差异,我们猜测血小板释放的某种物质促进NETs形成。血小板活化释放多种生物活性物质,5-HT为其中含量较为丰富的物质之一。出乎意料,我们发现5-HT抑制PMA诱导的NADPH氧化酶依赖途径和Ionomycin诱导的非NADPH氧化酶依赖途径典型NETs形成。此外,机体95%血清素储存于血小板中,我们发现慢加急性肝衰竭患者血浆和ADP刺激后5-HT释放量低于慢乙肝患者。5-HT可抑制NETs形成,但慢加急性肝衰竭患者血小板水平降低,以及血浆和血小板内5-HT水平降低,这可能是慢加急性肝衰竭患者进展期NETs形成的促进因素之一但在体外实验中,分离不同肝病进程患者外周血中性粒细胞并加入PMA和Ionomycin刺激,在PMA刺激180分钟后慢加急性肝衰竭患者的离体中性粒细胞NETs形成明显少于慢乙肝患者,提示慢加急性肝衰竭患者中性粒细胞在体NETs形成能力的受损。结果与文献报道肝硬化和急性肝损伤患者中性粒细胞功能受损具有一致性。以上结果提示慢加急性肝衰竭患者NETs形成调控因素复杂,有待进一步研究。三、血清素对中性粒细胞外网形成的影响接下来我们主要关注了5-HT对NETs形成的影响。我们发现5-HT可能通过作用于HTR2b而调控NETs形成,但无法检测到HTR2b的mRNA表达,考虑可能原因为中性粒细胞HTR2b的转录水平不活跃,下一步需检测中性粒细胞上HTR2b的蛋白水平。ROS产生、自噬发生、PMNE核转位、组蛋白H3瓜氨酸化、钙离子内流和组蛋白H1、H4的降解为NADPH氧化酶依赖途径NETs形成的重要环节,目前可以确定的是5-HT影响其中ROS形成和PMNE核转位,但不能抑制组蛋白H3瓜氨酸化。对自噬发生、钙离子内流和组蛋白H1、H4降解的影响需要进一步确认。综上推测,在肝窦内,血小板激活并和中性粒细胞结合,诱导中性粒细胞ROS生成和PMNE核转位,NETs形成；血小板聚集粘附与NETs上,其活化后释放多种生物活性物质,5-HT水平升高；局部高浓度的5-HT激活随后聚集于此的中性粒细胞上的HTR2b,抑制其ROS生成和PMNE核转位从而抑制了NETs形成。