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目的:构建纯合型Plin1基因敲除小鼠品系,为研究PLIN1相关功能提供专属特异的动物模型;观察Plin1基因敲除对高脂饲料诱导小鼠肥胖的相关影响;进一步探究PLIN1对脂肪组织脂质代谢和炎症水平的作用及其可能分子机制。方法:1.通过显微注射、CRISPR/Cas9和胚胎移植技术构建Plin1基因敲除小鼠,并进行品系纯化。根据Plin1基因2号外显子序列设计、筛选、合成sgRNA后构建质粒型sgRNA表达载体,双酶切法和基因测序验证载体构建是否成功;按照sgRNA试剂盒说明书体外转录sgRNA,琼脂糖凝胶电泳检测sgRNA的完整性和片段大小,超微量分光光度计测定sgRNA纯度和浓度;HCG和PMSG诱导8-10周龄雌性C57BL/6j小鼠超数排卵,之后与同周龄雄性小鼠合笼以获取受精卵;利用显微注射技术将sgRNA与Cas9蛋白的混合物递送至受精卵原核中;注射后状态良好的受精卵胚胎移植入假孕雌鼠输卵管伞端,F0代小鼠19-21 d后出生提取其DNA,PCR扩增Plin1基因,琼脂糖凝胶电泳和基因测序验证和筛选F0代嵌合体小鼠;F0代嵌合体小鼠与同窝别的野生型异性小鼠近交,19-21 d孕鼠分娩获得F1代小鼠,琼脂糖凝胶电泳法检测Plin1基因片段大小,筛选杂合型阳性敲除小鼠;杂合型阳性敲除异性小鼠同窝别近交,19-21 d后获得F2代小鼠,按照上述方法进一步检测Plin1基因片段大小,筛选出纯合型Plin1基因敲除小鼠;纯合型异性小鼠Plin1基因片段大小近交扩群,子代出生后提取DNA进行基因鉴定,若结果均为纯合型则表明Plin1基因敲除小鼠品系构建成功。Western blot和RT-PCR法检测小鼠脂肪组织、肝组织及骨骼肌中PLIN1蛋白及mRNA表达水平进一步区分野生型小鼠、杂合型Plin1基因敲除小鼠及纯合型Plin1基因敲除小鼠。2.研究Plin1基因敲除对小鼠肥胖和脂肪组织脂质代谢的作用及机制。12只雄性野生型C57BL/6j小鼠和12只Plin1基因敲除小鼠,随机分为4组（n=6）:对照组（CON-C组）,野生型小鼠6只,敲除组（KO-C组）,Plin1基因敲除小鼠6只,均饲以D12450B对照饲料（10%脂肪热能,3.85 kcal/g）;高脂组（CON-H组）,野生型小鼠6只,敲除高脂组（KO-H组）,Plin1基因敲除小鼠6只,均饲以D1245145%高脂饲料（45%脂肪热能,4.7 kcal/g）。12周后。检测小鼠体重、体长及摄食量变化;实验结束前2周,葡萄糖耐量实验测定小鼠糖耐量水平;胰岛素耐受实验测定小鼠胰岛素抵抗水平;利用耗氧量测定比较小鼠能量代谢率;实验结束后处死所有小鼠,试剂盒在各组小鼠血清中检测TG、TC、甘油、NEFAs、LDL-c和HDL-c水平;观察并称量比较各脏器变化;HE染色后观察白色及棕色脂肪组织病理形态学变化;RT-PCR法检测脂肪组织中hsl、atgl、fas及acc基因mRNA表达差异;Western blot法在各组小鼠白色脂肪组织中检测HSL、p-HSL、ATGL及SREBP1蛋白表达差异;体外培养小鼠脂肪组织并施加胰岛素（INS）或异丙肾上腺素（ISO）干预,检测培养基中NEFAs和甘油水平。3.研究Plin1基因敲除对肥胖小鼠脂肪组织炎症反应的影响及机制。取各组小鼠血清及部分附睾脂肪组织体外培养基,酶联免疫吸附试验在小鼠脂肪组织培养基和血清中测定TNF-α、IL-6及MCP-1的水平;IHC染色法观测白色脂肪组织中炎性标志分子F4/80的表达程度;IHF（单标）染色法观察白色脂肪组织中NF-κB亚基P65的转位及表达水平;RT-PCR法检测附睾脂肪组织中tnf-α、il-6及mcp-1 mRNA表达差异;Western blot法检测附睾脂肪组织中NF-κB亚基P65表达及磷酸化差异。结果:1.成功设计并构建Plin1基因的质粒型sgRNA表达载体,体外转录获得了浓度大于5000 ng/L高纯度的完整sgRNA;完成了受精卵的原核注射和胚胎移植,野生小鼠Plin1基因片段大小为1236 bp,敲除小鼠Plin1基因片段大小为495bp;获得了纯合型Plin1基因敲除小鼠(Plin1-/-)及品系;杂合型Plin1基因敲除小鼠脂肪组织、肝脏及骨骼肌中PLIN1蛋白表达及mRNA水平显著降低（P<0.05）,纯合型Plin1基因敲除小鼠脂肪组织、肝脏及骨骼肌中PLIN1蛋白及mRNA基本无表达。2.喂养12周后,与CON-C组相比,KO-C小鼠体重、体长、摄食量、GTT水平无显著改变（P>0.05）,能量代谢率和ITT水平升高,白色脂肪组织重量减轻,脂滴空泡占比减小,而棕色脂肪组织中脂滴空泡占比增加（P<0.05）,血清HDL-c和NEFAs水平显著升高（P<0.05）,脂肪组织中脂解酶ATGL、HSL及p-HSL表达及mRNA水平升高,SREBP1c表达及fas和acc基因mRNA水平降低（P<0.05）,脂肪组织基础状态下培养基中甘油和NEFAs水平升高,INS干预后培养皿中甘油和NEFAs水平降低程度较小（P<0.05）,ISO干预后培养基中的甘油和NEFAs水平变化程度不显著。与CON-C组相比,CON-H组小鼠明显肥胖,代谢率降低,GTT及ITT水平升高（P<0.05）,肝脏及脂肪组织重量增加,脂肪组织中脂滴面积均增大,血脂水平升高（P<0.05）,脂解酶表达及mRNA水平降低,SREBP1表达及fas和acc基因mRNA水平升高（P<0.05）,脂肪组织基础状态下培养基中甘油和NEFAs水平升高,INS干预后培养皿中甘油和NEFAs水平降低程度较小（P<0.05）,ISO干预后培养基中的甘油和NEFAs水平变化不显著。与CON-H组相比,KO-H组体重显著降低,能量代谢率显著升高（P<0.05）,白色脂肪组织重量减轻,脂滴空泡占比减小,而棕色脂肪组织中脂滴空泡占比进一步增加,血清TG、TC及NEFAs水平显著减低,HDL-c、LDL-c及甘油水平升高（P<0.05）,脂肪组织中脂解酶表达及mRNA水平均升高,SREBP1c表达及fas和acc基因mRNA水平降低（P<0.05）,脂肪组织基础、INS及ISO干预培养基中甘油和NEFAs水平均升高（P<0.05）。3.与CON-C组相比,CON-H组小鼠血清与脂肪组织培养基中TNF-α和IL-6水平均显著升高,MCP-1水平表现为在血清中变化不显著而在脂肪组织培养基中显著升高（P<0.05）。脂肪组织中M1型巨噬细胞浸润增多、NF-κB P65荧光强度及核转位增多、p-P65表达升高,tnf-α、il-6及mcp-1基因mRNA水平显著升高（P<0.05）;KO-C组小鼠血清和脂肪组织具有类似改变,但tnf-α和il-6基因mRNA表达水平无显著变化。与CON-H相比,KO-H组小鼠血清中IL-6和MCP-1无显著改变,TNF-α水平显著升高,而在脂肪组织培养基中上述分子水平均显著升高。脂肪组织F4/80表达、P65荧光强度及核转位、p-P65表达及促炎基因mRNA均显著升高（P<0.05）。结论:1.利用CRISPR/Cas9、显微注射和胚胎移植技术成功构建了Plin1基因敲除小鼠,并获得了稳定遗传的纯合型Plin1基因敲除小鼠(Plin1-/-)及其品系,为研究PLIN1的相关功能提供了专属特异的动物模型。2.Plin1基因敲除通过上调脂解酶、下调脂质合成转录因子及下游靶基因的表达,促进小鼠脂肪组织中脂解作用并抑制了脂质合成,改善了HFD诱导的小鼠肥胖。3.Plin1基因敲除促进肥胖小鼠脂肪组织的炎症反应,其机制可能为PLIN1失活介导的脂解加剧,促进了M1型巨噬细胞的极化与浸润,并激活NF-κB通路导致促炎因子的合成与释放。