补肾益智方(BSYZ)是由广州中医药大学赖世隆教授负责的课题组针对老年性痴呆的主要病理机制、总结长期临床经验并结合现代药理学研究成果设计而成,全方针对痴呆的病因病机,标本同治。本研究参照治疗老年性痴呆中药临床前药效学研究方法,根据补肾益智方的药物特点、功能主治,开展补肾益智方药理作用机制的研究。目的:虽前期的临床研究显示,补肾益智方在治疗AD的141例随机双盲测试中,综合显效率为61.9%,MMSE均值增加3.17分,但其具体作用机制尚不明确。本研究旨在明确补肾益智方对阿尔茨海默病模型鼠的防治作用及其可能机制。方法:一、补肾益智方HLPC指纹图谱及其质量评价研究本部分实验采用HPLC指纹图谱分析方法,对补肾益智胶囊进行了成分分析,并对不同批次提取的补肾益智胶囊进行质控,确定实验的一致性。二、补肾益智方对AD小鼠学习记忆及氧化应激-凋亡相关机制的研究1.轻度认知障碍动物模型制备:本研究采用东莨菪碱腹腔注射致AD动物模型。主要针对轻度认知障碍疾病研究,通过腹腔注射2mg/kg东莨菪碱,致小鼠记忆下降。2.BSYZ对AD小鼠学习记忆功能的影响:选择8月龄昆明小鼠54只,随机分为正常组、模型组、阳性药组、BSYZ低剂量组、BSYZ中剂量组、BSYZ高剂量组。BSYZ低、中、高剂量组给药剂量分别为1.46g/kg·d、2.92g/kg·d、5.84g/kg·d,正常组和模型组以0.9%生理盐水等量灌胃,阳性药对照组给予安理申3mg/kg。每日1次,给药共14天。第8-14天,每天灌胃给药后30min,对小鼠进行腹腔注射东莨菪碱2 mg/kg(正常对照组以等量生理盐水替代),造模后30min进行Morris水迷宫检测动物的学习记忆能力。3.BSYZ对AD小鼠氧化应激和细胞凋亡调控影响:采用比色法测定各组小鼠脑组织中SOD活力、MDA和GSH水平;TUNEL染色法检测脑组织细胞凋亡情况;Western Blot法和免疫荧光法检测脑内凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2蛋白表达情况;HE染色和Nissl染色检测脑组织切片细胞凋亡和病理学变化。三、补肾益智方对AD大鼠学习记忆及胆碱能-营养因子相关机制研究1.胆碱能损伤致痴呆模型制备:本研究采用脑内双侧Meynert基底核注射鹅膏蕈氨酸(IbotenicAcid,IBO)诱导胆碱能系统损伤模型大鼠。主要针对胆碱能损伤致痴呆疾病的研究,通过脑立体定位仪对SD大鼠Meynert基底核双侧注射IBO各5μg,致大鼠记忆能力损伤。2.BSYZ对AD大鼠学习记忆功能的影响:选择3月龄SD大鼠80只,随机分为假手术组、模型组、阳性药组、BSYZ低剂量组、BSYZ中剂量组、BSYZ高剂量组。IBO造模后恢复3天后灌胃给药,BSYZ低、中、高剂量组给药剂量分别为1.46g/kg·d、2.92g/kg-d、5.84g/kg·d,假手术组和模型组以0.9%生理盐水等量灌胃,阳性药对照组给予安理申3mg/kg,每日1次。连续给药30天后开始Morris水迷宫和新事物识别测试,检测动物的学习记忆能力。3.BSYZ对AD大鼠胆碱能系统和营养因子调控影响:采用免疫组化法和荧光定量PCR法检测乙酰胆碱转移酶(ChAT)、神经生长因子(NGF)以及NGF受体(高亲和力受体TrkA和低亲和力受体p75)在不同脑区的分布和表达及其mRNA水平;ELISA法检测脑内乙酰胆碱(Ach);比色法检测ChAT活性和乙酰胆碱酯酶(AchE)活性;Western Blot法检测脑组织ChAT、AchE及凋亡相关蛋白Caspase-3的蛋白表达水平;TUNEL染色、HE染色和Nissl染色检测脑组织切片细胞凋亡和病理学变化。四、补肾益智方对SAM小鼠学习记忆及炎症因子相关机制的研究1.BSYZ对SAM小鼠学习记忆功能的影响:选择6月龄快速衰老亚系8(SAMP8)小鼠56只,随机分为模型组、阳性药组、BSYZ低剂量组、BSYZ中剂量组、BSYZ高剂量组。以同月龄抗速衰老亚系1(SAMR1)小鼠12只作为正常组。BSYZ低、中、高剂量组给药剂量分别为1.46g/kg·d、2.92g/kg·d、5.84g/kg·d,正常组和模型组以0.9%生理盐水等量灌胃,每日1次,给药共30天。给药结束后,采用Morris水迷宫和跳台实验检测动物的学习记忆能力。2.BSYZ对SAM炎症与应激的影响:采用免疫组化法检测脑组织PPARγ、COX-2、GFAP、NF-κB和Bcl-xl的分布和表达;荧光定量PCR法检测脑内IL-1β和IL-6的mRNA水平;比色法检测SOD、GSH-Px活性和MDA含量;TUNEL染色、HE和Nissl染色检测脑组织细胞凋亡和病理学变化。五、补肾益智方有效部位群预防阿尔茨海默病的活性筛选研究通过采用RTCA法检测补肾益智方8个有效部位(每个有效部位7个浓度梯度)对PC12细胞活力的影响。筛选出补肾益智方有效部位发挥药效时间和浓度。结果:一、补肾益智方成分分析及质量控制建立了补肾益智方的HPLC指纹图谱,用乙腈-磷酸水溶液进行线性梯度洗脱,检测波长203nm,确定了 8个共有峰。并测定了 6味药材的有效成分人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl、齐墩果酸、蛇床子素、欧前胡素、丹皮酚、二苯乙烯苷、芍药苷,其含量均达到药典规定的要求。且不同批次补肾益智方胶囊成分与对照图谱基本一致。二、补肾益智方对AD小鼠学习记忆及氧化应激-凋亡相关机制的研究1.对学习记忆的影响.:各组定位航行逃避潜伏期随训练时间增加呈现缩短趋势。模型组第3-5天逃避潜伏期比正常组延长,差异有统计学意义(第3、4天:P<0.05,第5天:P<0.01);与模型组比,补肾益智方中剂量组第5天逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。空间探索中,模型组穿越平台次数和平台象限活动时间比正常组减少(P<0.01);与模型组比,补肾益智方中、高剂量组穿越平台次数和平台象限活动时间增加,差异有统计学意义(P<0.05)。2.对氧化应激通路的影响:模型组SOD活力比正常组下降,补肾益智方中剂量组SOD活力比模型组升高。模型组MDA含量比正常组增加,补肾益智方中剂量组MDA含量比模型组减少。海马GSH含量组间比较,模型组比正常组减少,补肾益智方中、高剂量组比模型组GSH含量增加。3.对细胞凋亡的影响:模型组Bcl-2蛋白表达较正常组低(P<0.01),模型组Bax蛋白表达较正常组高(P<0.01);与模型组相比,补肾益智方中剂量组逆转了Bcl-2、Bax蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.01)。TUNEL染色法检测细胞凋亡,可见海马区模型组凋亡细胞比正常组增加(P<0.01);补肾益智方中、高剂量组较模型组有明显改善(P<0.05),低剂量组也有改善,但差异不明显。三、补肾益智方对AD大鼠学习记忆及胆碱能-营养因子相关机制研究1.对学习记忆的影响:模型组大鼠的水迷宫逃避潜伏期较假手术组延长,差异有统计学意义(第2天:P<0.05;第3-5天:P<0.01);模型组大鼠新物体偏好指数较假手术组下降(P<0.01)。补肾益智方缩短了水迷宫逃避潜伏期,其中低、高剂量组在定位航行最后2天逃避潜伏期相比模型组差异有统计学意义(第4天:低、高剂量均为P<0.05;第5天:低、高剂量分别P<0.05、P<0.01);而各剂量组对新物体偏好指数均有改善作用(P<0.05,P<0.01)。2.对胆碱能通路的影响:模型组与假手术组相比,脑内Ach含量减少,ChAT活性和AchE活性下降;ChAT在海马和皮质区的表达减少;ChAT和AchE蛋白和mRNA水平下调。补肾益智方增加Ach含量及ChAT、AchE活性;增强ChAT在海马和皮质区的表达;上调ChAT和AchE蛋白和mRNA水平。3.对NGF通路的影响:模型组NGF、TrkA和p75在海马和皮质区的表达均较假手术组减少,mRNA水平也下调。补肾益智方增加了 NGF表达并上调mRNA水平,以低剂量和高剂量组较为明显。补肾益智方对TrkA的表达有轻微上调作用;对TrkA mRNA也表现为上调作用,以中、高剂量对皮质区的作用较明显。补肾益智方增加p75在皮质区的表达,并呈现随剂量增加表达增加的趋势;同时上调了 p75 mRNA水平,以高剂量组作用较为明显。4.对细胞凋亡的影响:模型组与假手术组相比,Caspase-3蛋白表达下降,TUNEL阳性细胞数增加;同时伴有脑组织病理形态学的改变。补肾益智方下调Caspase-3蛋白表达、减少TUNEL阳性细胞数、改善脑组织病理形态学变化。四、补肾益智方对SAM小鼠学习记忆及炎症因子相关机制的研究1.对学习记忆的影响:模型组各天逃避潜伏期均比正常组延长,差异有统计学意义(第1、2天:P<0.05,第3-5天:P<0.01);给药组与模型组相比,补肾益智方低剂量组在第5天逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。空间探索实验中:模型组平台穿越次数和平台象限活动时间比正常组减少(P<0.01);与模型组相比,补肾益智方低剂量组在平台象限活动时间比模型组明显增加(P<0.05);补肾益智方低、中剂量组平台穿越次数增加,但差异无统计学意义(P>0.05)。跳台实验结果显示:模型组错误次数比正常组增多(P<0.01);与模型组相比,补肾益智方低、中剂量组错误次数均减少(分别为:P<0.01,P<0.05);补肾益智方高剂量组小鼠错误次数也比模型组减少,但差异无统计学意义(P>0.05)。2.对炎症通路的影响:模型组COX-2、GFAP和NF-κB在海马、皮质的表达较正常组增加;与模型组比,补肾益智方各剂量组在海马和皮质区COX-2、GFAP和NF-κB均有不同程度下调。模型组PPARγ在皮质的表达较正常组明显减少;与模型组比,补肾益智方各剂量组在皮质区PPARy表达增加,在海马区有轻度改善作用。模型组IL-1β mRNA的表达较正常组明显增加,与模型组比,补肾益智方各剂量组IL-1βmRNA均减少;模型组IL-6mRNA表达较正常组明显增加,补肾益智方给药组与模型组比差异无统计学意义,但有轻微下调趋势。3.对氧化应激通路的影响:模型组SOD的活性较正常组明显下降,补肾益智方低剂量组SOD活力比模型组升高。模型组MDA的含量较正常组明显增加,补肾益智方各剂量组均比模型组减少。模型组GSH-Px的活性较正常组明显降低,补肾益智方各剂量组比模型组GSH-Px活性增加。4.对细胞凋亡的影响:模型组Bcl-xl在海马、皮质的表达较正常组明显减少;与模型组比,补肾益智方给药组在皮质区Bcl-xl增加,在海马区低剂量组有明显改善作用,中剂量组与模型组比无显著差异,但有改善趋势。与模型组比补肾益智方给药组能够减少TUNEL阳性细胞数、改善脑组织病理形态学变化。五、补肾益智方有效部位群预防阿尔茨海默病的活性筛选研究本实验探讨了补肾益智方有效部位对Aβ1-42诱导的PC12细胞损伤模型的保护作用,采用RTCA法实时监测细胞增殖情况,以明确其预防治疗痴呆的作用剂量、作用时间等,为本方的再次开发提供参考。结果表明补肾益智方有效部位群(F1-F8)的药效不呈剂量依赖性。其中有效部位F3和F7对Aβ1-42诱导的PC12细胞损伤模型的促增殖作用较稳定。结论:补肾益智方对三种痴呆模型的学习记忆能力均有改善作用。实验研究表明补肾益智方对神经元凋亡、胆碱能损伤、营养因子失调、氧化应激损伤、炎症因子激活等有不同程度的调节作用,起到改善多个AD病理变化,延缓神经退行性疾病的发病进程的作用。因此,补肾益智方以“补肾”法治疗老年性痴呆有着较好的开发前景,可以调节AD相关的多个信号通路或靶标,有可能为神经退行性病变的治疗带来新的希望。