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目的:血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)具有收缩型与合成型两种表型。血管损伤时,血流动力学发生改变及局部细胞因子释放,管壁各层细胞成分发生变化,中膜VSMC由收缩型转化为合成型,并大量增殖,导致管腔狭窄。骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种分泌型的糖基化磷蛋白,是VSMC由收缩表型向合成表型转化的标志。OPN通过RGD序列与细胞表面的多种整合素受体,如αvβ3、αvβ5、αvβ1等相互作用而调节细胞黏附、迁移、增殖等多种生物学行为。而合成肽SVVYGLR已被证明在多种炎性反应如类风湿性关节炎中起治疗作用。因此,我室设计合成具有以上两种黏附基序的13肽分子-GRGDSVVYGLRSK-,以此作为诱骗寡肽阻断OPN与整合素的相互作用,观察其在OPN诱导的血管平滑肌细胞黏附与迁移中的抑制作用,并初步探讨其机理。方法:通过黏附、迁移实验观察RGD13肽对细胞黏附、迁移活性的抑制效应;免疫荧光定位分析观察RGD对OPN诱导的VSMC黏着斑形成的影响;Western blot和免疫沉淀分析检测RGD对OPN诱导的ILK去磷酸化的作用;RT-PCR、Western blot和酶图分析检测RGD对OPN诱导的MMP-2表达和活性的影响。结果:1 OPN和RGD对VSMC增殖活性的影响。MTT分析结果表明,不同浓度的OPN(20、40、80μg/mL)对VSMC增殖活性具有轻度的诱导作用,且呈剂量依赖性。当用不同浓度的RGD13肽预孵育后,则OPN诱导的VSMC增殖活性被抑制。10μg/mL的RGD13肽可完全消除OPN的促增殖效应。2 RGD抑制OPN诱导的VSMC黏附。细胞黏附分析结果表明,OPN可剂量依赖性的提高VSMC的黏附活性,当OPN浓度达到20μg/mL时VSMC黏附活性较对照组有明显升高(P<0.05)。用RGD预孵育VSMC 1 h后,VSMC在OPN包被孔板上的黏附受到抑制; RGD对细胞粘附活性的抑制效应具有剂量依赖性。结果提示,RGD可阻断OPN诱导的VSMC黏附。3 RGD抑制OPN诱导的VSMC粘着斑形成。以整合素耦联激酶(ILK)为标志物,用免疫荧光分析观察黏着斑的形成,结果显示,未经OPN处理的VSMC用ILK单克隆抗体进行免疫荧光染色后,胞质内出现散在点状分布的细小荧光颗粒;细胞经20μg/mL OPN孵育5、10、30、60 min后,胞质内的荧光颗粒逐渐增多、形成束状整齐排列的黏着斑轮廓;用RGD(5μg/mL)预孵育1 h后再经OPN处理的VSMC,其胞质内荧光颗粒减少,荧光强度变弱,表明黏着斑形成受到抑制。4 RGD抑制OPN诱导的ILK去磷酸化作用。已经证实,在OPN促细胞黏附信号的跨膜转导中,伴有ILK的脱磷酸化。免疫沉淀和Western印迹分析结果显示,在静止期细胞中ILK的苏氨酸磷酸化水平较高,OPN刺激使其磷酸化程度下降,至30 min时降到最低,与对照组比较,磷酸化的ILK降低55.4%。经过RGD预孵育1h后,随着RGD浓度的增高,OPN诱导的ILK去磷酸化作用被消除。提示RGD可阻断OPN信号的跨膜传导。5 RGD抑制OPN诱导的VSMC迁移。伤口愈合实验显示,OPN可以提高VSMC的迁移活性。RGD预孵育后,OPN诱导的VSMC迁移被抑制;在所观察的浓度范围内,10μg/mL RGD对OPN诱导的VSMC迁移的抑制作用最强。与对照组相比,RGD使VSMC平面迁移和跨膜迁移活性分别降低57 %和52 %。由此,RGD对OPN诱导的VSMC迁移具有显著的抑制作用。6 OPN诱导MMP-2表达和活性。基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases 2, MMP-2)在VSMC迁移中发挥着重要的作用,为了阐明OPN诱导VSMC迁移是否与调节MMP-2活性有关,我们检测了OPN对该基因表达的影响。Western blot和RT-PCR结果显示, OPN可以剂量依赖性和时间依赖性地诱导MMP-2的表达。酶图分析显示,在同样条件下,MMP-2酶活性也平行升高。结果表明,OPN诱导VSMC的迁移与提高MMP-2的表达和活性有关。7 RGD抑制OPN诱导的MMP-2表达和活性。Western blot和RT-PCR结果显示,不同浓度的RGD预孵育VSMC 1 h后,能够消除OPN诱导的VSMC中MMP-2的表达。在所观察的浓度范围内,10μg/mL RGD对OPN诱导的MMP-2表达的抑制作用最强。与对照组相比,RGD预处理后,OPN诱导的MMP-2的mRNA和蛋白表达水平分别降低了68 %和59 %。此外,酶图分析可见,RGD预孵育也明显降低MMP-2水解明胶的活性。结果提示,RGD抑制OPN诱导的VSMC迁移活性与降低MMP-2的表达和活性相关。结论:1 RGD可以剂量依赖性抑制OPN诱导的VSMC黏附。2 RGD抑制OPN诱导的黏着斑的形成。3 RGD可消除OPN诱导的ILK去磷酸化效应。4 RGD剂量依赖性抑制OPN诱导的VSMC迁移。5 RGD可以拮抗OPN诱导的MMP-2的表达及活性。