研究背景 恶性肿瘤严重危害人们的健康，据WHO统计，在全世界50多亿人口中平均每年死于恶性肿瘤者达690万人，新发病例为870万例，且数字还在逐年增加。在我国，根据卫生部2004年公报资料，2003年恶性肿瘤仍稳居我国部分市县疾病死因之首。 淋巴瘤起源于淋巴结或其他淋巴组织，分为霍奇金病(Hodgkindisease，HD)和非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkinlymphoma,NHL)两大类，其中以B淋巴细胞最为常见。 在本篇论文中主要涉及到B细胞性非何杰金氏淋巴瘤。非何杰金氏淋巴瘤是一种常见的恶性淋巴肿瘤，治疗非何杰金氏淋巴瘤有很多常规方法，以放疗和化疗为主，但放疗和化疗毒副作用大且选择性不强，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织细胞也有毒害作用，而且很容易产生内在性或获得性多药耐药(Multi-drugresistance，MDR)和复发，并且对中度和高度恶化的B-cellNHL的缓解率很低。因此只杀伤肿瘤细胞而正常细胞不受损害的靶向治疗一直受到关注。单克隆抗体因其特异性高，本身具有细胞毒作用，可携带药物，毒物和放射性同位素而成为靶向治疗的主要策略。 目前肿瘤的单克隆抗体导向治疗是一个研究十分活跃的领域，且取得了可喜的成果。对非霍奇金淋巴瘤(NHL)的单克隆抗体导向治疗就是一个较为成功的例子，目前临床治疗效果最好的还是抗CD20抗体。 但由于抗体片段Fab及F(ab)2是抗原结合活性片段，缺少Fc段细胞生物学功能，且Fab及F(ab)2的分子量较小，因此血浆半衰期比较短，影响了它的疗效。 目的 本实验主要构建用于表达治疗B淋巴细胞非何杰金氏淋巴瘤的抗CD20基因工程抗体的真核表达载体。研制的该抗体片段已拥有我国独立知识产权，与国外同类产品相比有以下优势：基因工程抗体片段诱导肿瘤细胞凋亡作用更强；与CD20抗原结合的表位不同，可能在抗B-cellNHL耐药方面更具有优势，研制成功后有望取代国外同类产品。真核表达载体的优势在于：真核中抗体蛋白可正确折叠和糖基化，产生更接近人的结构分子，将有更好的活性；因为全抗大分子在原核中产量较低，因此在真核表达，相对于原核，产量将有所提高。 研究方法 主要通过基因工程及分子生物学方法，采用PCR手段，分别合成全抗体的轻链和重链，通过限制性内切酶酶切，利用5和3的黏性末端，连接等方法，将抗体片段导入真核表达载体质粒PEE14中，转化入感受态细胞，涂于含有amp的琼脂糖凝胶的平板上，过夜生长然后通过PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定出含有导入质粒的阳性菌株，交由生物公司测序。然后通过构建的分别含有抗CD20全抗体轻链和重链的PEE14质粒，通过多克隆接头，改造PEE14质粒，消除SalI位点，加入notI位点，然后通过中间载体pcdna3.1，将轻链和重链基因同时转入同一真核表达载体PEE14中。 结果 构建了分别含有抗CD20全抗体轻链和重链的PEE14质粒； 改造了pcdna3.1过渡载体，去掉了一个SalI位点，加入了NotI位点。 构建了抗CD20全抗体轻链和重链同时在一个表达载体上的PEE14质粒，有两套顺序，一套为轻链在前，重链在后；另一套为重链在前，轻链在后。 结论 为下一步将载体导入到CHO细胞系中，与脂质体共转染做准备。