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背景和目的:Y-27632是Rho相关激酶(Rho associated kinase,ROCK)的抑制剂,能够通过调节肌动蛋白微丝骨架重构,参与细胞的增殖、凋亡、迁移、分化等许多的细胞生命活动。目前,已有研究表明Y-27632对胚胎干细胞、脂肪干细胞及前列腺干细胞等具有促进增殖、分化和维持干性的作用[1-3]。此外,也有研究发现,Y-27632对牙髓细胞具有促进迁移的作用[4],因此,我们在一定程度上可推测Y-27632有用于牙周组织再生的可能性。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是从人牙周膜韧带组织中分离出来的间充质干细胞,具有多种方向分化的能力,能分化成成纤维样细胞、成骨样细胞和成牙骨质样细胞,在组织再生和创伤修复中起着重要的作用,被认为是牙周组织再生的种子细胞。本研究是在体外培养人PDLSCs的基础上,观察不同浓度Y-27632对PDLSCs增殖、凋亡、迁移、分化及干性维持等生物学行为的影响,并探讨其促进PDLSCs增殖的作用机制,为牙周炎的临床诊疗提供一种新的策略和思路。方法:(1)分离培养PDLSCs:用有限稀释法从因正畸需要而拔除的健康前磨牙或牙周健康的第三磨牙上分离、培养PDLSCs,取3～6代活性良好的细胞用于后续的实验。(2)细胞活性检测:利用细胞活性检测试剂盒(cell-counting kit-8,CCK8)检测方法、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)掺入实验和克隆形成率实验检测不同浓度Y-27632对PDLSCs增殖状态及生长活性的影响。(3)细胞凋亡检测:细胞经凋亡检测试剂盒染色后,借助流式细胞术检测Y-27632对PDLSCs凋亡的影响。(4)迁移能力检测:通过Transwell迁移试验和细胞划痕实验检测Y-27632对PDLSCs趋化和迁移的作用。(5)成骨分化能力检测:用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性实验检测Y-27632作用7、14天后PDLSCs的ALP活性,用茜素红钙盐染色法检测Y-27632作用28天后PDLSCs钙结节形成的情况,并用西砒氯铵(cetylpyridinium chloride,CPC)比色法进行钙定量。用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测 Y-27632 作用后 PDLSCs 成骨相关基因ALP 和 Runt 相关转录因子 2(runt related transcription factor 2,Runx2)的表达情况。(6)成脂分化能力检测:用油红O染色法检测Y-27632作用21天后PDLSCs脂滴形成的情况,并用异丙醇溶解比色法进行半定量分析。用qRT-PCR检测Y-27632作用后PDLSCs成脂相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARy)和脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)的表达情况。(7)干性检测:用qRT-PCR检测Y-27632作用3天和7天后PDLSCs干性相关基因c-Myc,Nanog,Klf4和Oct4的表达情况。(8)Y-27632对PDLSCs增殖的机制研究:用CCK8检测细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)抑制剂 U0126 对 Y-27632 促进的PDLSCs增殖的影响。用Western blot检测Y-27632对ERK/MAPK信号通路和P38/MAPK信号通路的激活情况。(9)统计分析:所有数据均采用SPSS19.0统计学分析软件进行单因素方差(one-wayANOVA)分析,将P<0.05视作具有统计学意义。结果:(1)成功分离培养出状态良好的PDLSCs。(2)CCK8实验和EdU掺入实验结果表明10μM和20μM Y-27632能够促进PDL7SCs的增殖(P<0.05),且浓度为20μM时促进细胞增殖的效应达到高峰(P<0.01).克隆形成率实验结果表明Y-27632对PDLSCs克隆形成能力无明显影响(P>0.05),但是,Y-27632处理组细胞克隆呈现星网状,细胞形态更加伸展。(3)流式细胞技术检测细胞凋亡的结果表明Y-27632对PDLSCs的凋亡无明显影响(P>0.05)。(4)Transwell迁移实验和细胞划痕实验结果均表明Y-27632能够增强PDLSCs的迁移能力(P<0.05)。(5)ALP活性实验结果发现,PDLSCs经过7天和14天的成骨诱导培养后,10μM和20μM Y-27632能够明显降低细胞的ALP活性(P<0.01);茜素红染色和CPC比色法的结果从定性和定量两个方面均表明Y-27632能够显著抑制矿化结节的形成,减少钙盐的沉积(P<0.01);qRT-PCR结果表明PDLSCs经Y-27632处理14天后其成骨相关基因ALP和Runx2的表达水平均明显下调(P<0.01)。(6)油红O染色和异丙醇溶解比色的结果从定性和定量两个方面均表明Y-27632能够促进脂滴的形成,促进成脂分化(P<0.01);qRT-PCR结果显示PDLSCs经Y-27632处理14天和21天后其成脂相关基因PPARγ和LPL的表达水平均明显上调(P<0.05)。(7)qRT-PCR结果显示Y-27632能够上调细胞培养3天和7天的干性相关基因标志物c-Myc、Nanog、Klf4和Oct4的基因表达水平(P<0.05)。(8)Y-27632通过ERK信号传导通路促进PDLSCs增殖。CCK8结果表明ERK的抑制剂U0126抑制Y-27632诱导的PDLSCs增殖(P<0.05)。Western blot结果表明Y-27632能够上调磷酸化ERK的表达水平,同时,抑制剂U0126能使上调的磷酸化ERK的表达水平下降。但是,Y-27632对磷酸化p38的蛋白表达水平无明显作用(P>0.05),这就可以证明参与Y-27632促进PDLSCs增殖的信号传导通路是ERK信号通路而不是p38信号通路。结论:本实验证实Y-27632能够提高PDLSCs的增殖活性和迁移能力,并且能够维持细胞干性,促进脂滴的形成,但对ALP活性和矿化结节的形成呈现抑制作用。其次,我们也证实,Y-27632促进PDLSCs增殖的分子机制是激活了 ERK信号传导通路。因此,我们可以推测借助Y-27632促进PDLSCs迁移至损伤部位,然后促进这些细胞增殖,并能维持细胞干性的特性,有望达到促进牙周组织再生和修复的目的。