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梨(Pyrus L.)是国际性大宗水果，也是我国除苹果、柑橘外的第三大水果，种植面积逾11l万公顷。我国是东方梨的主要起源地，种类和品种十分丰富，其中包括部分珍贵的红皮梨资源。红皮梨外观鲜艳诱人，在国内外市场上倍受消费者青睐，也逐渐受到科研和生产单位的重视。定位东方梨红皮/绿皮性状对阐明其遗传机理、指导红皮梨新品种选育具有重要的意义。本研究利用中国农业科学院郑州果树研究所配置的红皮梨杂交育种组合群体，开展了东方梨红皮性状袁型观察与初步分析，东方梨红皮/绿皮性状区间定位，东方梨红皮/绿皮性状分子标记开发与验证和梨红皮/绿皮性状及相关基因连锁群归集等方面的研究，以期为分子标记辅助红皮梨育种和红皮性状的进一步研究奠定基础。研究结果如下:
1.东方梨红皮性状表型观察与初步分析
以‘满天红’ב红香酥’和‘玉露香’ב满天红’两个红皮梨杂交育种群体为材料，连续2年采用色差分析、人工判定等方法，对东方梨红皮/绿皮性状表型和遗传规律进行研究。结果显示:红色以果点为中心向四周扩散，近果点位置颜色最深，远离果点位置颜色逐渐减淡。刮开的皮层未观察到有绿色色素的积累，整体表现为红色的盖色部分与无色透明部分交错的斑驳状。亲本基因型对后代的红皮梨数量和着色程度有较大的影响，‘玉露香’ב满天红’组合比‘满天红’ב红香酥’组合能产生更多和着色能力更强的红皮梨后代。气候条件对红色东方梨的着色也具有较大的影响，2014年的气候条件比2015年更有利于红皮梨着色。
2.东方梨红皮，绿皮性状区间定位
对‘满天红’ב红香酥’杂交组合极端表型单株中28个红皮梨单株的DNA混合池、27个绿皮梨单株的DNA混合池和这些杂种单株具有相对表型的4个祖代亲本材料DNA进行重测序后，利用QTL-Seq方法以‘砀山酥’梨基因组为参照，进行集群分离分析(BSA)。结果通过将子代池间|△(SNP-index)|≥0.6的SNP与2个亲本池间差异且纯合的SNP取交集，从4，134，489个SNP中初选了545个候选SNP，获得其中聚集分布的SNP组成的2.97Mb的初选区间。同时，以200Kb为窗口，20Kb为步长对各Scaffold进行滑动窗口扫描，绘制|△（SNP-index)|曼哈顿图，选择Top0.5％的区间作为候选区间，最终得到了1.86Mb的东方梨红皮/绿皮性状候选区间，包括分别位于11个ScaffoId的14个子区间。初选区间内的少数子区间，由于滑窗扫描时位于设置的阈值线以下，所以未进入最终候选区间。
3.东方梨红皮/绿皮性状分子标记开发与验证
根据BSA区间定位的结果，选择信号区间内的genic-SSR引物和根据候选区间设计的InDel及SSR引物对‘满天红’ב红香酥’群体内所有单株进行连锁分析。结果表明，In2130-12、In2130-16、ln2130-19和ZFRIl30-16等4对引物对群体内的红皮和绿皮单株区分效果最好，能够将该群体中299株已结果杂种单株中的全部117个红皮梨单株鋈定出来。连锁分析获得1个长度为19.2cM的连锁群，In2130-16标记与红皮/绿皮性状的遗传距离最近，为2.5cM，In2130.12、In2130-19和ZFRll30-16等标记与目标性状位点相距2.6cM。进一步扩大群体验证结果表明，In2130-12、In2130-16和ZFRll30-16等3对引物在供试‘玉露香’ב满天红’群体458个单株中仍然具有较好的区分能力，群体内310个结果单株的基因型与袁型的符合率都在90％以上。但在以‘红香酥’为父本的半同胞优系和供试的栽培品种中，3个标记显示出区分效果的差异。引物ZFRIl30-16的区分效果最好，正确率达到97.87％，仅在一个优系材料上表现出错误的带型，在供试栽培品种中全部区分正确。ZFRIl30-16标记可以作为分子标记应用于相关红皮梨杂交组合辅助选择育种。
4.梨红皮/绿皮性状及相关基因连锁群归集
以Wu等2014年绘制的SSR和SNP遗传图谱为参考图谱，通过共同的Scaffold和共同的分子标记，将本研究定位的候选区间、花青苷途径基因和西洋梨红皮性状位点定位到同一遗传图谱上进行比较。结果本研究定位的东方梨红皮/绿皮性状候选区间所在的Scaffold除Scaffold3.0被归集到第15连锁群外，其余Scaffold均位于第5连锁群上。而前人定位的西洋梨红皮性状基因Red和控制红皮性状的位点RFS则分别被归集到第4和第3连锁群。东方梨红皮/绿皮性状候选区间和西洋梨红皮性状基因位点未能归集到同一连锁群，说明东方梨红皮性状和西洋梨红皮性状形成的分子机制存在不同。花青苷途径基因中，PcCHS、PpCHSl被归集到第4连锁群，与西洋梨红皮基因位点Red较为接近:PpDFRl和PpCHS3被归集到第15连锁群，其中PpDFRl位于东方梨红皮/绿皮性状候选基因区间内，PpCHS3位置与PpDFRl所在Scaffold接近。这些基因可能分别与西洋梨和东方梨红皮梨的着色有较为密切的关系。
1.东方梨红皮性状表型观察与初步分析
以‘满天红’ב红香酥’和‘玉露香’ב满天红’两个红皮梨杂交育种群体为材料，连续2年采用色差分析、人工判定等方法，对东方梨红皮/绿皮性状表型和遗传规律进行研究。结果显示:红色以果点为中心向四周扩散，近果点位置颜色最深，远离果点位置颜色逐渐减淡。刮开的皮层未观察到有绿色色素的积累，整体表现为红色的盖色部分与无色透明部分交错的斑驳状。亲本基因型对后代的红皮梨数量和着色程度有较大的影响，‘玉露香’ב满天红’组合比‘满天红’ב红香酥’组合能产生更多和着色能力更强的红皮梨后代。气候条件对红色东方梨的着色也具有较大的影响，2014年的气候条件比2015年更有利于红皮梨着色。
2.东方梨红皮，绿皮性状区间定位
对‘满天红’ב红香酥’杂交组合极端表型单株中28个红皮梨单株的DNA混合池、27个绿皮梨单株的DNA混合池和这些杂种单株具有相对表型的4个祖代亲本材料DNA进行重测序后，利用QTL-Seq方法以‘砀山酥’梨基因组为参照，进行集群分离分析(BSA)。结果通过将子代池间|△(SNP-index)|≥0.6的SNP与2个亲本池间差异且纯合的SNP取交集，从4，134，489个SNP中初选了545个候选SNP，获得其中聚集分布的SNP组成的2.97Mb的初选区间。同时，以200Kb为窗口，20Kb为步长对各Scaffold进行滑动窗口扫描，绘制|△（SNP-index)|曼哈顿图，选择Top0.5％的区间作为候选区间，最终得到了1.86Mb的东方梨红皮/绿皮性状候选区间，包括分别位于11个ScaffoId的14个子区间。初选区间内的少数子区间，由于滑窗扫描时位于设置的阈值线以下，所以未进入最终候选区间。
3.东方梨红皮/绿皮性状分子标记开发与验证
根据BSA区间定位的结果，选择信号区间内的genic-SSR引物和根据候选区间设计的InDel及SSR引物对‘满天红’ב红香酥’群体内所有单株进行连锁分析。结果表明，In2130-12、In2130-16、ln2130-19和ZFRIl30-16等4对引物对群体内的红皮和绿皮单株区分效果最好，能够将该群体中299株已结果杂种单株中的全部117个红皮梨单株鋈定出来。连锁分析获得1个长度为19.2cM的连锁群，In2130-16标记与红皮/绿皮性状的遗传距离最近，为2.5cM，In2130.12、In2130-19和ZFRll30-16等标记与目标性状位点相距2.6cM。进一步扩大群体验证结果表明，In2130-12、In2130-16和ZFRll30-16等3对引物在供试‘玉露香’ב满天红’群体458个单株中仍然具有较好的区分能力，群体内310个结果单株的基因型与袁型的符合率都在90％以上。但在以‘红香酥’为父本的半同胞优系和供试的栽培品种中，3个标记显示出区分效果的差异。引物ZFRIl30-16的区分效果最好，正确率达到97.87％，仅在一个优系材料上表现出错误的带型，在供试栽培品种中全部区分正确。ZFRIl30-16标记可以作为分子标记应用于相关红皮梨杂交组合辅助选择育种。
4.梨红皮/绿皮性状及相关基因连锁群归集
以Wu等2014年绘制的SSR和SNP遗传图谱为参考图谱，通过共同的Scaffold和共同的分子标记，将本研究定位的候选区间、花青苷途径基因和西洋梨红皮性状位点定位到同一遗传图谱上进行比较。结果本研究定位的东方梨红皮/绿皮性状候选区间所在的Scaffold除Scaffold3.0被归集到第15连锁群外，其余Scaffold均位于第5连锁群上。而前人定位的西洋梨红皮性状基因Red和控制红皮性状的位点RFS则分别被归集到第4和第3连锁群。东方梨红皮/绿皮性状候选区间和西洋梨红皮性状基因位点未能归集到同一连锁群，说明东方梨红皮性状和西洋梨红皮性状形成的分子机制存在不同。花青苷途径基因中，PcCHS、PpCHSl被归集到第4连锁群，与西洋梨红皮基因位点Red较为接近:PpDFRl和PpCHS3被归集到第15连锁群，其中PpDFRl位于东方梨红皮/绿皮性状候选基因区间内，PpCHS3位置与PpDFRl所在Scaffold接近。这些基因可能分别与西洋梨和东方梨红皮梨的着色有较为密切的关系。