研究背景心脏移植术是终末期心脏衰竭的治疗手段之一。然而,供心不足成为了心脏移植术发展的瓶颈。即使现在,为了寻找捐献的供心而远赴国外的患者及其家属仍不在少数。然而事实上,国外的医院也难以确保有充足的供体心脏以满足日益增长的心脏移植术需求。因此,很多患者到了国外也不一定能接受心脏移植术,患者及其家属长时间的等待给社会及其家庭带来了沉重的经济负担。供心供给不充分的重要原因之一,是供心无法长期保存。目前,供体心脏的保存方式普遍采用低温保存液浸泡保存的方式。但由于细胞水肿、细胞酸中毒、代谢底物耗竭等原因,其保存的安全时限只有4-6小时。因此,寻找一种新的器官保存方法是具有必要性的。相关研究表明,缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury, IRI)是心脏移植最常见的病理过程,是导致移供体心脏术后早期功能不全的主要原因和晚期并发症(如冠状动脉血管病变)的主要相关因素。因此,减轻缺血再灌注损伤是心脏移植能否成功的关键。目前,大量的实验和临床资料均表明心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注过程中心肌损伤的重要病理学基础之一,该病理生理过程受多种基因表达的调控,如Bcl-2、Bax和半胱氨酸天冬氨酸酶(Cysteine aspartase, Caspase)家族。因此,我们可以从抗心肌细胞凋亡途径保护供体心脏,这将为心脏移植提供了新的研究角度。1998年,Seki等发现由40000个细胞组成、拥有神经细胞的水熊虫在体内水分减少的状态下,被暴露于6000个大气压的极限高静水压环境后复苏并存活,并建议该成果能够应用于多细胞生物的保存。最初,Seki等通过使用全氟化碳(perfluorocarbon, PFC)溶液提供干燥环境保存离体小鼠心脏,然后再对离体心脏进行复苏,但发现实验结果重复率并不理想。然而,这代表着一种全新的脏器保存方法——脏器干燥保存方法开始在实验室得到运用。一氧化碳(Carbon Monoxide,CO)被认为是一种毒性气体,具有强烈的致命性。然而随着一氧化氮作为气体信使分子作用逐渐被发现,同样为气体小分子的CO,其在体内的生理作用也深受关注,CO成为第二种可以治疗疾病的体内重要信号分子。近年来研究表明,CO可以通过其血管舒张效应、抗凝、抗凋亡、抗炎症等机制发挥其对移植器官的缺血再灌注损伤的保护作用。因此,日本研究人员结合干燥保存脏器技术和CO对移植器官的缺血再灌注损伤现象具有保护作用的优势,发明CO高压干燥保存这一全新方法,Yoshida等将离体小鼠心脏暴露在总压力为2个标准大气压的不同比例混合气体(CO和O2)当中,放置在一个特制高压罐保存24小时,通过降低水分和气体环境的代谢抑制来提高心脏保存效果,然后再将离体心脏进行颈部异位移植,结果发现在P02:PCO=4:1条件下,小鼠心脏复跳率最为理想(复跳率为80%)。随后,Hatayama等用同样的气体干燥保存方法保存离体小鼠心脏,但混合气体总压力和比例有所不同(P02=3000hPa,PCO=4000hPa),心脏保存时间延长至48小时,结果发现小鼠心脏复跳率为100%。但是,上述的研究结果当中的机制尚不明确,仍然停留在现象阶段,并且实验动物对象只停留在小鼠层面,检测终点只有心脏复跳率、复跳心脏的心电图等较为主观的检测指标,所以需要对CO高压干燥保存方法的相关分子机制作进一步的探究,这可以为这种全新的心脏保存方法的临床研究提供科学依据。因此本研究在家兔腹腔异位移植基础上,延长供心保存时间至18小时,探讨CO高压干燥保存方法抗移植心脏心肌细胞凋亡的效果及其可能机制。研究目的及意义在日方研究人员对CO高压干燥心脏保存方法研究基础上,本实验采用新西兰兔作为实验动物,进一步探讨此方法在不同物种的可行性,同时验证CO高压干燥心脏保存方法抗心肌细胞凋亡的效果及其可能机制,为该方法的基础研究提供科学依据。因此,通过中日科学家的合作,针对于改进和完善供体脏器保护技术,以及解决可供移植脏器严重不足这两大突出问题,该实验具有十分重要的意义。研究创新之处(1)以新西兰兔作为实验对象研究CO高压干燥保存方法的保存效果。(2)本实验采用新西兰兔作为实验动物,弥补了日方在CO高压干燥心脏保存方法这一技术基础只开展在小鼠层面的欠缺, 日方在前期实验已确立CO高压干燥保存方法在保存小鼠心脏方面的显著效果,但检测终点只有心脏复跳率、复跳心脏的心电图等较为主观的检测指标,本实验在蛋白层面初步探讨CO高压干燥保存方法可能的保存机制,同时验证CO高压干燥保存方法抗心肌细胞凋亡的效果及其可能机制,为该方法的基础研究提供科学依据。研究方法(1)将48只新西兰兔随机分成三组,其中空白对照组(修剪好的供心后,立即将供心作移植处理)有8对,HTK浸泡组(将修剪好的供心放在无菌盘中水浴,用注射器将5m1的HTK溶液从主动脉缓慢地顺灌到心肌中,再将心脏完全浸泡在装有HTK溶液的玻璃皿当中,最后将该玻璃皿放在4℃环境下保存18小时)有8对,CO高压干燥组(将修剪好的供心放在无菌盘中水浴,用注射器将5m1的KH溶液(含有4倍高渗葡萄糖)从主动脉缓慢地顺灌到心肌中,再将心脏悬挂于特制高压气体罐中缓慢加压后保存18小时,其中总体压力缓慢提升至4000hPa, PaO2::PaCO=4:1)有8对,其中特制CO高压干燥保存罐见图1-1。(2)建立兔心腹腔异位移植灌注模型,将新西兰兔麻醉后切开后腹膜,沿着血管鞘钝性分离并且暴露腹主动脉以及下腔静脉。首先,在腹主动脉上选定理想吻合位置,用血管夹阻断主动脉的上下两端；其次,切开腹主动脉,切口大小应该大于供体主动脉的口径；最后用肝素水冲洗腹主动脉,将供体心脏主动脉和受体腹主动脉行端侧吻合。同样,上述相同操作用在供体心脏主肺动脉和受体下腔静脉吻合上。开放血管夹检查吻合口有无出血,若有出血,则需针对出血处进行补针。等待心脏恢复规则有力搏动后,将其放置安稳,确保吻合的血管无扭曲以及压迫。(3)待供体心脏复跳1小时后,测定各实验组血清心肌酶(肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)及同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、谷草转氨酶(Aspartate transaminase, AST)),取各实验组供心的心肌组织后,用Wsetern免疫印迹法(Wstern Blot)法检测移植术后心肌细胞Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白的表达情况,采用原位末端标记染色法(Transferased UTP nick end labelling, TUNEL)检测心肌细胞凋亡阳性率,利用苏木素伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining, HE staining)评估心肌组织病理学改变。研究结果(1)与空白对照组相比,CO高压干燥保存组、HTK浸泡组血清中CK、CK-MB、LDH、AST含量均显著增多。而与HTK浸泡组,CO高压干燥保存组血清中CK、CK-MB、LDH、AST含量均显著减少(P<0.05)(2)与空白对照组相比,CO高压干燥保存组、HTK浸泡组的心肌细胞Caspase-3表达均显著增多,而Bcl-2/Bax表达均显著减少(P<0.05)。与HTK浸泡组,CO高压干燥保存组的心肌细胞Caspase-3表达均显著减少,而Bcl-2/Bax表达均显著增大(P<0.05)。(3)与空白对照组相比,CO高压干燥保存组、HTK浸泡组的心肌组织凋亡细胞阳性率均显著增多(P<0.05),而与HTK浸泡组,CO高压干燥保存组的心肌组织凋亡细胞阳性率均显著减少(P<0.05)(4)光镜观察显示：与CO高压干燥组和HTK浸泡组相比,空白对照组间质水肿较为明显,心肌细胞断裂、溶解较少,细胞核多为饱满、圆状。而与CO高压干燥组相比,HTK浸泡组可见更多的溶解、断裂的心肌细胞,且胞质水肿、细胞核固缩、溶解及消失更明显。研究结论与传统的HTK浸泡保存供心方法相比,CO高压干燥保存方法更能通过抗心肌细胞凋亡从而提高供心保存效果,这通过调节Bcl-2/Bax蛋白表达比值,抑制Caspase-3的激活,从而抑制缺血再灌注后心肌细胞的凋亡,但具体机制仍有待于进一步研究。