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致病性大肠杆菌分为肠道致病性大肠杆菌和肠道外致病性大肠杆菌,它们引发大肠杆菌病,危害人类和动物健康。肠道致病性大肠杆菌是一种重要的人畜共患病病原;其中禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)与人源性肠道外致病性大肠杆菌共享和交换部分毒力因子,具有相似的致病机制。因此对致病性大肠杆菌毒力因子的研究,有重要的公共卫生学意义。致病性大肠杆菌的毒力因子很多,主要包括黏附素、侵袭素、摄铁因子、毒素等,其中,摄铁因子对细菌的生存和感染十分关键。病原菌一般通过铁结合复合物系统和血红素系统摄取宿主体内的铁,整个铁摄取过程受到铁吸收调节蛋白Fur(ferricuptake regulator,Fur)的调控。种类繁多的铁转运系统也在大肠杆菌的铁摄取机制中扮演重要角色。最近研究表明,一部分摄铁因子不仅具有摄取铁的功能,还可能参与代谢调节和致病机制。ireA是近年来发现的一种摄铁因子,它编码和铁摄取相关的外膜受体,研究发现ireA可能与UPEC的毒力相关,但其在APEC中的功能尚未见报道。Fur由fur基因编码,通过抑制铁的吸收来维持细菌铁平衡,近年来科学家们发现fur与细菌多种生理特性有关,并可能参与细菌的致病机制。本研究选取禽致病性大肠杆菌DE205B和肠出血性大肠杆菌SH13,分别构建ireA基因和fur基因的缺失株,通过荧光定量PCR、生长曲线测定、黏附试验、环境耐受试验、动物感染试验等,来探究摄铁因子在致病性大肠杆菌中的作用及机制。1.ireA 基因在禽致病性大肠杆菌DE205B中的功能研究对ireA基因在临床分离的大肠杆菌中的分布进行了调查,在140株不同背景的致病性大肠杆菌中,ireA的检出率为32.9%;其中,A群大肠杆菌中的检出率为19.0%(12/63),B1群为19.2%(5/26),而致病力较高的B2群和D群的检出率分别为58.8%(10/17)和55.9%(19/34)。用荧光定量PCR的方法分析ireA基因在高铁和低铁生长环境下的mRNA表达情况,结果显示,ireA在低铁环境下的表达量是高铁环境下的1.8倍(P<0.01)。为研究ireA基因在APEC中的功能,利用Red同源重组技术构建DE205B的ireA基因缺失株,利用互补质粒pSTV28构建相应的互补株,并对缺失株和野生株的生物学特性进行了分析。生长曲线测定显示,缺失株DE205B△ireA的生长特性较野生株未发生明显改变(P>0.05);缺失株中大多数摄铁相关基因表达量较野生株显著升高(P<0.05),表明ireA基因在DE205B中参与了铁摄取相关基因的调节;黏附试验结果显示,缺失株对鸡胚成纤维细胞DF-1的黏附力较野生株显著下降(P<0.05);环境耐受试验结果显示,缺失株对高渗环境(2.4MNaCl for 1 h)、碱性环境(Tris-HCl,pH10.0,30min)和低温应激的耐受能力分别相对于野生株下降25.42%(P<0.05)、21.17%(P<0.01)和70.0%(P<0.01)。动物感染试验结果显示,ireA基因的缺失对DE205B的致病力无显著影响(P>0.05)。2.肠出血性大肠杆菌SH13中fur基因的生物学特性研究fur基因编码并调控铁吸收调节蛋白Fur,在细菌的摄铁系统中发挥重要作用,有研究发现,它可能参与了病原菌的致病机制。选取EHEC菌株SH13作为研究对象,探究fur基因在致病性E.coli中的作用。对Fur蛋白进行了重组表达,并通过western-blot试验证明其具有免疫原性。将SH13菌株在M9缺铁培养基和M9+Fe富铁培养基(0.01mM FeSO4)中培养,分别检测fur基因的mRNA表达量,结果显示,fur基因在富铁培养基中的表达量和缺铁培养基相比升高了约1.4倍(P<0.01),表明fur参与了EHEC的铁吸收调节。构建了SH13的fur基因缺失株SH13△fur和互补株SH13C△fur,并对野生株和缺失株的生物学特性进行了比较。生长曲线表明,野生株和缺失株的生长情况无明显差别(P>0.05);黏附试验结果显示,野生株和缺失株对喉癌细胞系HEp-2细胞的黏附能力无明显差异(P>0.05);耐酸(pH4.0)、耐碱(pH10.0)和高渗透压环境(2.4M)的耐受试验结果显示,fur基因提高了细菌对酸性环境的耐受力(P<0.05),但对碱性和高渗透压环境的耐受无显著影响(P>0.05);小鼠的攻毒试验结果显示,野生株和缺失株的LD50无明显差异(P>0.05),表明fur基因对EHEC的致病力无直接影响。